新疆库尔勒香梨主要病毒的分子检测研究

【摘要】：我国果树主栽品种多数携带病毒。随着果树面积的不断扩大和栽培时间的延长，病毒的危害越来越明显，已引起广大科技人员重视，无病毒化生产是防治病毒病的主要措施。果树无毒化生产要求一种准确、灵敏、简便、快速的病毒检测方法，传统的木本指示植物检测，准确可靠，但耗时长；血清法检测常因抗血清制备难度大而价格昂贵。因此，为满足果树苗木检疫和无毒化生产的需要，摸索一种准确、灵敏、快速、简便的检测方法十分必要。近年来分子检测技术为果树病毒的检测提供了新的有力工具，使果树病毒的检测提高到了一个新水平。新疆的库尔勒香梨因其独特的风味品质而受到广大消费者的喜爱，是新疆出口创汇的主要产品之一。但近年来，发现新疆的香梨也普遍带有病毒，给新疆的香梨发展带来巨大的隐患，因此，开展新疆香梨病毒分子检测研究具有十分重要的理论和实际意义。 本研究主要包括库尔勒香梨主要病毒RT-PCR检测技术、多重RT-PCR检测技术、cDNA探针检测技术、原位RT-PCR检测技术等检测体系的建立和优化。 1．获得了适合于梨叶片及1—2年生枝皮层(可周年获得)的总RNA、dsRNA、总核酸提取方法，所提取的总RNA可很好地用于RT—PCR研究，所提取的总核酸可很好地用于核酸杂交试剂盒及RT—PCR试剂盒的周年检测。 2．根据ACLSV、ASPV、ASGV三种病毒基因组序列分别设计了相应引物，扩增出683bp、361bp、273bp保守特异性片断用于RT—PCR、NASH、ISRT—PCR检测。三个片段转入E. Coli并进行测序比较分析后，其核苷酸相似性分别为83.75％、79.5％和92.3％。三种病毒特异引物具有相同的退火温度等特点 可‘以使它们用于多重Rl，一PCR检测。 3.优化了香梨病毒的RT一PCR检测方法，结果表明，要获得良好的RT 一PCR扩增，RT体系中dNTPs浓度、互补引物、AMV的浓度要分别达到 0.1 75mmol/L、0.35林mol/L、0.5U单L以上;此外，使用RNasin能有效抑布ljRT 体系中RNase对病毒RNA的降解作用，可使RT过程顺利进行;PCR体系中 dNTPS浓度至少要达到0.15mmol/L，在 o.Zmmol/L可以获得最佳的扩增效果; TaqE浓度要达到0.032u单L以上;引物浓度适宜范围0.2一1 .0件mol/L;Mg2+ 要达到1.2一2，Ommol/I-。 4，利用1个来自苹果线粒体的NADH脱氢酶亚基5基因的2个外显子‘一扫 间隔1个内含子的结构，克隆了1个na亦基因的181bp片段，该片段跨越内 含子分别部分覆盖了2个外显子，经测序比较分析后，表明一该片断与原序列的 核营酸相似率为98.9%。利用该181bP片段建立了一个植物mRNA上的na内 用作内参照共同扩增的病毒RT一PCR检测体系，包括ACLSV、ASGV、ASPv 三种病毒的内参照共扩增多重RT一PCR检测系统及一步法RT一PCR。结果表 明，该na办内标非常有效地解决了常规RT一PCR中难以规避的假阴性问题。 三种病毒的多重扩增及一步法RT一PCR可使病毒的检测更加高效。 5.利用ACLSV、ASGV、AsPV特异引物合成了该3种病毒的生物素标 记cDNA探针，在此基础上，对影响杂交灵敏度的主要因素进行了实验研究， 结果表明，当探针浓度为4oong/ml，甲酞胺浓度为45%，42℃杂交反应6h，可 获得最高灵敏度。进口硝酸纤维素膜的灵敏度最好，本底信号低。rp刃eenZo的 封闭效果比BSA好。针对常规核酸杂交过程长，操作复杂的问题，较大地改进 了杂交程序，使一个检测周期从22h缩减至sh。提高了病毒NASH检测效率。 6.组装了基于一步RT一PCR的内标控制检测试剂盒和基于生物素标记 cDNA探针的优化杂交检测试剂盒。用于2种试剂盒检测的病毒核酸样品通过 总核酸快速提取法获得，一步RT一PCR试剂盒使用了内标na石来严格控制假 阴性，生物素标记探针杂交检测试剂盒使用了优化的5h快速程序。实验结果 表明该试剂盒具有高效、快速、准确、稳定的优点。 7.用已知带有苹果褪绿叶斑病毒的香梨和无病毒实生苗叶一片为材料，利 用DIG标记，研究了香梨病毒的母t片石蜡切片IS一RT一PCR检测技术及茎尖 冰冻切片15一RT一pCR检测技术。包括Super Script 11逆转录酶、dNTps、RNasi;1 及互补引物浓度对cDNA合成的影响和退火温度、乙注TaqDNA聚合酶、Mg，十、 引物浓度及循环次数对原位PCR效果的影响。研究结果表明:RNasin的用量 大于0.2U单L时，信号强度随着RNasin量的加大而增强;只有当dNTPs浓度 达一ommol/L时刁‘能生成一定量的eDNA;Superseriptll浓度在1.0一10U恤L 均可进行正常的逆转录，而且在该范围内产物的量随SuPer SeriPtH浓度提高而 增多;引物浓度达到0.9扒mol/L以上时刁‘能进行有效的逆转录，并且生成的 cDNA的量随引物浓度增大而增加。原位扩增ACLSV的cDNA适合退火温度 为62oC。循环20一30次可出现较强的蓝色信号，引物浓度在0.8一1 .2林mol/L时显 色较好;LA Taq DNA聚合酶浓度为4u八00林L以上，均显示较深的蓝色;Mg2+ 浓度为1.smmol/L就可满足原位PCR所需。并利用:TthDNA聚合酶在植物病 毒检测上实验了一步15一Rl’- PCR。获得了香梨病毒的原位PCR优化检测体系。 结果表明病毒在香梨叶片的栅栏组织及0.2cm茎尖的皮层外围细胞、初生维管 束中滴度较高。