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《华南热带农业大学》 2004年
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灵芝药效基因及启动子的克隆

柳永  
【摘要】:灵芝是2000年《中华人民共和国药典》(一部)收录中药,具有多种明确的疗效。本研究以克隆灵芝药效相关基因及其内源启动子为目的。以期实现灵芝药效成分的发酵生产,获得灵芝有效成分的纯品,为获得成份准确可控的灵芝制剂提供技术支持。本研究共分为四部分: 第一部分免疫调节蛋白基因克隆。 我们设计了2对引物(GimPF1-GimPR1,GimPF2-GimPR2),利用基因组PCR技术从四种灵芝中克隆到11个片段,分别是:LY21(约620bp),LY22(约620bp),LY23(602bp),LY24(671bp),LY29(658bp),LY32(约750bp),LY33(约800bp),LY34(约750bp),LY35(约750bp),LY36(约750bp),LY37(约750bp)。其中4个片段(LY32,LY35,LY36,LY37)含有免疫调节蛋白基因全长序列。对4个不同灵芝来源的LZ-8基因进行比较,比较结果显示甜芝来源的免疫调节蛋白基因与其它3种灵芝(紫芝、韩芝和赤芝)来源的免疫调节蛋白基因具有一定的差异,在进化上分歧较早。紫芝、韩芝和赤芝相互之间发生进化分歧的时间则比较晚。 第二部分β-1,3-Glucan合酶克隆。 我们设计了2对引物(LgluF1-LgluR1,LgluF2-LgluR2),利用基因组PCR技术从赤芝中克隆了一个片段LY28(约1500bp),经BLAST分析并非目的基因,在gene bank中也没有高同源序列存在。 第三部分酪氨酸酶基因克隆。 我们设计了2对引物(TyragaF1-TyragaR1,TyrlenF2-TyrlenR2),利用基因组PCR技术从赤芝中克隆了8条序列,分别是:LY1.1(约1500bp),LY2.4(约750bp),LY3.1(1552bp),LY3.2(约800bp),LY5.3(约1500bp),LY9.2(约1000bp),LY10.2(584bp),LY11.1(约2100bp)。对这8条序列进行BLAST分析,核酸同源性分析结果显示,8条序列在Genebank中均无高同源性序列存在;氨基酸同源性分析结果显示,LY1.1和LY3.1与多种来源的26s蛋白酶体的调节亚基具有30%以上的同源性。 第四部分ras及gpd启动子的克隆。 这一部分的工作分3步完成: (1) 克隆部分。我们设计了5对引物(rasF1-rasR1,gpdF1-gpdR1,gpdF2-gpdR2,LgpdF1-LgpdR,LgpdF2-LgpdR),利用基因组PCR技术克隆到了12个片段,分别是:LY14.1(1373bp),LY15.1(682bp),LY16.1(404bp),LY17.1(724bp),LY18.3(1050bp),LY19.3(1243bp),LY20.1(812bp),LY25(1093bp),LY26(1179bp),LY27(740bp),LY30(约1200bp),LY31(613bp)。 (2) 结果分析。BLASTn分析结果显示,LY31与香菇gpd启动子具有98%同源性,可以认为是灵芝gpd启动子的一段序列。其余序列在Genebank中均未找到高同源序列。用启动子分析软件(Proscan V1.7和Promoter 2.0 Prediction)对所有 克隆序列进行分析,结果显示,LY26、LY14.1和LY17.1为高可能性启动子序列。 Proscan vl.7分析显示,LY26得分为7228(最低要求53.0),其正链569-819bP 为可能的启动子区;LY17.1得分为69.20(最低要求53.0),其反向的519-269bP 为可能的启动子区。Pro功。ter 2.OPrediction分析显示LY14.1为高可能性启动子序 列,假定转录起始位点处于700bP.此外,LY3.又启动子预测结果显示,其具有 潜在启动子活性。 (3)启动子活性检测。为了检验我们克隆的这些片段是否真的具有启动子活 性,我们共用3个可能的启动子序列分别替换掉pcA州[B LA1301表达载体中GUs 基因前的355启动子,从而构建成3个新的启动子活性检测载体,即EP3 .1, EP 193,Ep31。并进行草菇的电转化试验,对拟转化子进行GUS检测.依据拟 转化子的GUS检测结果,我们初步认为LY 193(用于构建EP19.3表达载体的假 定启动子序列),具有弱启动子活性;石丫31(用于构建EP31表达载体的假定启动 子序列,该序列与砚过启动子具有98%的同源性)具有较强启动子活性。
【学位授予单位】:华南热带农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S567.31

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