橡胶树胶乳中膜结合型焦磷酸酶基因的克隆和表达研究

【摘要】：植物组织中有两种类型的焦磷酸酶(pyrophosphatase PPase),一类是细胞质中可溶性的无机焦磷酸酶(inorganic PPase),另一类是与细胞液泡膜结合的不可溶性焦磷酸酶(vacuolar PPase,V-PPase)。后者除了水解焦磷酸(PPi)外,还具有质子泵的功能。 巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)乳管中V-PPase是调控橡胶生物合成的一个关键酶。它结合于黄色体膜上,除了降解橡胶生物合成过程中产生的PPi之外,还与ATPase协同作用,构成一个完整的质子泵体系,维持黄色体的稳态,调节细胞内的酸碱度,使胶乳中inorganic PPase处于最适的生理环境,及时地催化降解乳管中过多的PPi,从而保证橡胶生物合成能顺利地进行。 为了研究橡胶树胶乳中V-PPase基因表达的分子调控机理,本研究首先利用简并引物,扩增到胶乳中V-PPase基因的一个cDNA片段。然后运用RACE技术,在该cDNA片段的基础上得到了橡胶树胶乳V-PPase基因的全长cDNA序列(已提交GENEBANK,登录号:AY514019)。V-PPase基因可读框(ORF)全长2307bp,编码一分子量约为84.7kDa的769AA的酶蛋白。Northern杂交结果显示,外源茉莉酸(JA)处理橡胶树割面后2天内,胶乳中V-PPase基因的mRNA含量和对照无明显差别,2天后其含量开始逐渐升高,并在第6天达到最大值。外源乙烯(ET)处理橡胶树割面2天后,胶乳中V-PPase基因的转录水平开始升高,第4天达到最大值,并将持续保持至第8天,然后转录水平有所回落,并于第10天下降至原有的对照水平。 本研究还测定了外源JA和ET对胶乳V-PPase酶活性的影响。结果表明,(1)外源JA处理橡胶树割面8小时候后,胶乳中V-PPase的酶活性显著升高,并在第4天达到最大值,此后开始逐步回落,但与对照相比,酶活性仍然保持在较高的水平;(2)外源ET处理橡胶树割面后,胶乳中V-PPase的酶活性有所升高,但升高的趋势和幅度不如外源JA诱导的明显。 应用PET-EP原核表达系统,表达了橡胶树胶乳V-PPase基因可读框(ORF)中的一段cDNA序列,得到了分子量约为32kD的蛋白产物,为制备胶乳V-PPase的抗体和开展V-PPase的组织化学定位等后期研究工作奠定了基础。