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《华南热带农业大学》 2005年 博士论文
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番木瓜乳管特异表达启动子的克隆及功能分析

杨英军  
【摘要】:目前,启动子是国内外研究的一个热点,已发现了大量组织特异性启动子和诱导型启动子。热带果树番木瓜作为理想的生物反应器植物受体,在其乳管系统中表达外源蛋白具有易收获、易分离纯化等诸多优点,因此,分离番木瓜乳管特异表达的启动子具有重要意义。 本研究以我国优良的番木瓜品种“穗中红”为试验材料,利用染色体步移技术获得了番木瓜乳管中两种重要的蛋白酶proteinase omega基因和chymopapain基因的启动子区序列,并利用基因工程的原理和方法,构建了这两个基因启动子的缺失载体,分别采用基因枪轰击法和农杆菌介导的转化法将这些载体导入番木瓜的叶片和烟草中,进行了GUS基因的瞬时表达研究和稳定整合研究,以分析启动子各区段的功能,获得的主要结论如下: 1.经过三次染色体步移,从番木瓜品种“穗中红”基因组中克隆到了蛋白酶proteinase omega基因(登录号:X66060)的部分序列及其启动子区序列,片段全长1,505 bp,3′端长466 bp的片段与番木瓜的proteinase omega基因的5′端同源性为96%;5启动子区长度为1,039 bp,在数据库中没有搜索到同源区段,表明为第一次克隆得到。将全长序列递交GenBank数据库,登录号为AY695444。通过Promoterprediction软件对proteinase omega基因启动子区分析,结果表明在905 bp-955 bp和947 bp-997 bp的位置存在可能的基础启动子序列,其可能性分别为0.79和0.66,推测转录起始位点(即帽结构)为ATG前面的第50位的T或92位的A。进一步用PlantCARE软件对5′上游远端调控序列进行顺式作用元件分析,发现多种重要元件如TATA-box、CAAT-box、Atl-motif、HSE、I-box、ABRE、ERE、EIRE等。 2.利用染色体步移技术从“穗中红”基因组中分离到蛋白酶chymopapain基因(登录号:X97789)的部分序列及其5′侧翼区序列,片段全长719 bp,3′端长163bp的片段与番木瓜的chymopapain基因的5′端同源性为99%;5′侧翼区长度为556bp为启动子区,在数据库中没有搜索到同源区段,表明为第一次克隆得到。将全长719bp序列递交GenBank数据库,登录号为AY803756。用在线软件Promoter Prediction


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