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《华南热带农业大学》 2007年
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苦瓜MAP30蛋白功能区段缺失体构建及其生物活性研究

刘思  
【摘要】: MAP30(momordica anti-HIV protein of 30 kDa)是一种分子量为30 kDa的Ⅰ型核糖体失活蛋白,具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤活性,且能够特异诱导肿瘤细胞凋亡,对未感染的正常二倍体细胞几乎无毒性,不易产生耐药性,是一种很有前景的新型抗肿瘤、抗病毒候选药物。研究发现水解全长MAP30蛋白后得到小片段蛋白仍然具有全长MAP30抗肿瘤、抗HIV的活性,但是没有核糖体失活活性,说明MAP30的抗肿瘤、抗病毒和抗菌活性可能是由蛋白的不同部位所控制的,克隆其与抗肿瘤、抗病毒活性的相关区段基因并进行表达,这有利于获得低毒副作用、高活性的基因工程产品。 本研究通过PCR技术,从质粒pET30a-MAP30中克隆得到编码M1(D1-K195)、M2(D1-E187)、M3(A11-K195)、M4(A11-E187)四个功能区段缺失体蛋白的序列,经测序鉴定后亚克隆到原核表达载体pET22b中,表达载体用CaCl2介导的化学转化法转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,然后利用菌落PCR筛选阳性克隆。工程菌在28℃时经1mM IPTG诱导5h时实现高效表达,可溶性分析表明四种重组蛋白在大肠杆菌中都以包涵体形式存在。利用MTT法分析四个重组蛋白复性液的抗肿瘤活性,结果表明四个功能区段缺失体重组蛋白均对人羊膜细胞系wish、鼠髓白血病细胞系NFS-60、小鼠腹水瘤细胞S-180有杀伤作用,其中对鼠髓白血病细胞系NFS-60抑制作用最明显。M1、M2、M3和M4四个缺失体重组蛋白对NFS-60作用的半致死量分别为2.51μg/ml、2.42μg/ml、1.89μg/ml和1.90μg/ml。细胞毒性分析表明,四个重组蛋白对人正常肝细胞系HL-70的细胞毒性极小,其中M3的细胞毒性较其它三者低,且低于MAP30细胞毒性。 通过大肠杆菌制备的重组四个功能区段缺失体蛋白中以M3的抗肿瘤效果最佳,也优于全长MAP30,并且M3对正常细胞的细胞毒性亦最低。M3不包括MAP30核糖体失活活性的C端序列,对人体毒副作用更低,并且较全长MAP30蛋白减少了近100个氨基酸,预计制成基因工程药物后将更有利于人体的吸收利用,降低抗原抗体反应。因此功能区段缺失体蛋白M3是不仅具备MAP30优点,而且应用优势上优于MAP30,具有很大的临床应用价值和市场开发前景。
【学位授予单位】:华南热带农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q943.2

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【参考文献】
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