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Ph-Hv1a融合蛋白表达载体的构建及其表达产物的杀虫活性研究

赵丹丹  
【摘要】: 蜘蛛是昆虫的重要捕食性天敌,其毒素可麻痹和杀死昆虫,且大多数蜘蛛毒素对人类无害。ω-ACTX-Hv1 a是从澳大利亚漏斗蜘蛛分离到的,是一个无脊椎动物电控钙通道的抑制剂,是目前最有效的杀虫肽毒素。 本项研究将蜘蛛毒素肽基因ω-ACTX-Hv1a与AcNPV多角体蛋白基因重组,连入pET-30a表达载体,表达融合蛋白。对融合蛋白进行纯化,通过口途径饲喂瓜绢螟和斜纹夜蛾幼虫,以检测目的蛋白对两种虫的毒杀作用。首先分二步法合成ω-ACTX-Hv1a蜘蛛毒素基因:先合成中间部分DNA片段;再以合成的中间部分片段为模板,进行PCR反应,引入该基因的5’末端和3’末端DNA序列。以PAcUW21载体质粒DNA为模板,PCR扩增多角体蛋白基因。将两基因片段分别连入PCR Blunt克隆载体,测序结果表明连入的基因片段序列正确。表达载体的构建分为两步,先将Nde I/EcoR I双酶切下来的多角体蛋白基因连入表达载体pET30a,再将pET-30a-Ph与PCR Blunt-Hv1a经EcoR I /Xho I双酶切,所获得的Hv1a基因片段与具有EcoR I /Xho I末端的pET-30a-Ph相连接,构建表达载体pET-30a-ph-Hv1a,表达载体转化进入大肠杆菌BL21(DE3)。经1mmol/L IPTG,37℃下诱导4h表达外源蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果显示在大约34.5kD处有表达产物特异条带。通过对诱导温度(28、32、35、37、39℃)、诱导时间(1、2、3、4、5h)和IPTG诱导浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L)等诱导条件的改变,以确定最佳诱导表达条件为37℃下1mmol/L IPTG诱导4h,此时表达外源蛋白的量最高。经细胞超声波破碎、包涵体洗涤缓冲液洗涤获得纯化的融合蛋白,经纯化后获得了纯度为70%的融合蛋白。融合蛋白经口途径分别饲喂购买(组一)及自采(组二)两种来源的斜纹夜蛾幼虫和采自荒弃(组三)及产果(组四)两种黄瓜地的瓜绢螟幼虫。用浸过不同浓度的蛋白稀释液的菜叶饲喂昆虫。每组因蛋白稀释液液浓度的不同1:10,1:20和1:40而分三小组。结果表明,组四死亡率为80%,78.33%和71.67%。组三死亡率为35%,33.33%和26.67%,而组二的仅达到25%,10%和15%,组一为11.66%,6.67%和5%。


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1 赵丹丹;Ph-Hv1a融合蛋白表达载体的构建及其表达产物的杀虫活性研究[D];华南热带农业大学;2007年
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