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巴西橡胶树半胱氨酸蛋白酶基因HbCP1的克隆与表达分析

朱家红  
【摘要】: 天然橡胶是产胶植物的一种次生代谢物,它具有耐高温、高弹性等突出优点,是合成橡胶不可比拟的一种世界性工业原料和重要的战略物质,具有极高的经济价值及应用前景。天然橡胶的主要来源是巴西橡胶树(Hevea brasiliensis),目前有关巴西橡胶树形态、产胶生理及栽培学等方面的研究已取得了较大的进展,产胶量也达到了一定的水平。与其它农作物相比,橡胶分子生物学方面的研究仍相当滞后。 橡胶树的产胶功能是靠分布于树体内的乳管系统实现的,胶乳是乳管细胞的细胞质,内含大量的蛋白和酶,目前对这些蛋白和酶的功能还知之甚少。半胱氨酸蛋白酶是植物中重要的蛋白酶家族之一,广泛参与种子萌发、幼苗发育、胁迫响应、组织分化衰老和细胞程序性死亡等过程。研究半胱氨酸蛋白酶在橡胶树中潜在的生物学功能,具有重要的理论意义和实用价值。本研究对半胱氨酸蛋白酶基因进行了克隆,对其表达进行了分析,并对功能进行了预测。 根据不同植物半胱氨酸蛋白酶活性位点的保守氨基酸序列,通过PCR和RACE技术,从胶乳中克隆了编码半胱氨酸蛋白酶的基因,命名为HbCP1(GenBank登录号DQ642886)。该基因序列的长度为1597bp,包含一个1374bp的阅读框,编码457个氨基酸。推导的HbCP1分子量为50.63 kD,等电点为5.37。该氨基酸序列与木薯(Manihot escu lenta , AAX84673)、菜豆(Phaseolus vulgaris,CAB17076)、桔梗(Platycodon grandiflorμs, BAE80740 )、拟南芥(Arabidopsis thaliana, NP568620)和玉米(Zea mays, BAA88898)的半胱氨酸蛋白酶同源性分别是85%、76%、74%、70%和70%。 生物信息学分析表明,HbCP1包含3个结构域Peptidase C1A、GRAN和RTX以及由1个16个氨基酸残基组成的信号肽。结构域Peptidase C1A中含有3个酶活性催化反应中心,第147~158氨基酸位点为真核生物半胱氨酸蛋白酶的半胱氨酸活性位点,第287~297氨基酸位点为真核生物半胱氨酸蛋白酶的组氨酸活性位点,第304~ 323氨基为真核生物半胱氨酸蛋白酶的天冬酰胺活性位点。GRAN是一种颗粒体蛋白,参与创伤的修复。RTX结构域是细菌毒素家族蛋白所具有的一个功能域,在目前发现的植物半胱氨酸蛋白酶氨基酸均不含有RTX结构域。HbCP1是一个非跨膜的亲水性稳定蛋白;定位于液泡中,预测具有信号传导和胁迫应答的功能。 Southern杂交表明HbCP1基因橡胶树基因组中是低拷贝基因。 半定量RT-PCR结果显示,乙烯和伤害诱导胶乳HbCP1基因的表达,茉莉酸对HbCP1基因的表达几乎没有影响;HbCP1基因的表达具有组织差异性,在胶乳中大量表达,在叶片中次之,在树皮中微量表达。HbCP1基因在健康树、死皮树各组织(胶乳、叶片和树皮)中的表达没有太大差异。 通过对HbCP1的表达分析和HbCP1的生物信息学的分析表明HbCP1可能参与乙烯调节的信号传导途径,并能够对伤害做出响应,其在胶乳中可能具有防御功能。 构建四个原核表达载体:pET-30a-HbCP1、PGEX6P-1-HbCP1、pET-30a-EHbCP和PGEX6P-1-EHbCP1并进行了表达。结果表明HbCP1在大肠杆菌中的表达产物具有生理毒性,抑制自身的生长,RTX结构域是导致HbCP1表达产物具有生理毒性的原因。


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