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《华南热带农业大学》 2007年
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马槟榔甜蛋白基因(MBLⅡ)的拼接、载体构建与转化拟南芥的研究

宋宗应  
【摘要】: 甜味食品一直是人们日常饮食的重要组成部分,目前甜味食品的主要组成部分是蔗糖等碳水化合物和一些种类的人工合成甜味剂。医学表明人体过多食用糖类化合物易引发肥胖、糖尿病、高血压、冠心病等疾病。人工合成的甜味剂曾一度流行,但因有致癌的嫌疑且口味不纯正而逐渐退出了市场。因此寻找新的甜味剂成为研究的热门话题。甜蛋白因其纯天然,高甜度,不易引起肥胖等众多优点而逐渐受到了人们的青睐。 目前人们发现了六种甜蛋白,马槟榔(Capparis masaikal levi)为仅存在于我国亚热带局部地区的其中的一种。其种仁中含有甜蛋白mabinlin,甜度在重量基础上比较是蔗糖的400倍,有四中同系物,其中mabinlinⅡ能经受较长时间的高温处理而不失其甜味。因此受到了更多的关注。研究表明,mabinlinⅡ基因的cDNA包括465bp,翻译成155个aa的前蛋白,而成熟蛋白中由A链(33个aa)和B链(72个aa)通过非共价键结合形成,表明在mabinlinⅡ存在翻译后加工过程(去处部分肽段)。 本研究的目的是探究mabinlin基因的甜味表达,探索翻译后加工过程中连接肽、信号肽、N-端肽、C-端肽对蛋白甜味性质的影响。我们已得到以下结果: 1)从马槟榔总DNA中用PCR方法克隆到mabinlinⅡ基因(MBL),测序表明其序列与本实验室用RT-PCR方法从马槟榔总RNA克隆到的MBL序列仅有两个碱基的差异,同源率达99%,表明马槟榔MBL基因不含内含子。 2)利用重叠区基因拼接技术对MBL进行剪接,依次去除连接肽、信号肽、N-端肽、C-端肽所对应的DNA片段。 3)将MBL基因,以及基因剪切后的片段与组成型启动子和种子特异表达启动子连接,置于植物表达载体pVKH中,分别构建pVKH-35S-MBL -pA、pVKH-35S-NM-pA、pVKH-35S-MM-pA三个组成型植物表达载体和pVKH-Pm-MBL -pA、pVKH-Pm-NM -pA、pVKH-Pm-MM-pA三个种子特异表达植物载体。 4)通过中间载体PUC和PBS将A链和B链分别带上种子特异表达启动子LegA和Pm,再与载体pVKH相连,构建pVKH-Pm-S1-LegA-S2-pA双价植物表达载体。 5 )通过电击转化法将以上六种重组质粒pVKH-35S-MBL -pA、pVKH-35S-NM-pA、pVKH-35S-MM-pA、pVKH-Pm-MBL -pA、pVKH-Pm-NM -pA、pVKH-Pm-MM-pA转入农杆菌GV3101中获得转化工程菌。 6)将以上6个表达载体采用花粉管通道法转入拟南芥植物中。 7)通过抗生素潮霉素(Hyg)的MS培养基上的筛选,已获得能在抗生素培养基上生长的拟南芥抗性苗。分别将6个表达载体的拟南芥抗性苗移栽到土壤中,每个载体已分别得到了10-20株不等的T2代抗性苗。 8)对T2代抗性苗进行了PCR检测。单拷贝插入纯合子植株的筛选,基因剪切后的表达产物分析正在进行。
【学位授予单位】:华南热带农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q943.2

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