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《华南热带农业大学》 2007年
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纤维素酶系酿酒酵母载体的构建以及Pichia pastoris工程菌表达纤维素酶

屠发志  
【摘要】: 乙醇是当前正在大力推广应用的可再生能源之一。纤维素质物质是地球上最大量可再生的生物质资源。纤维素质物质中的纤维素在纤维素酶的作用分解成葡萄糖,而葡萄糖可以通过发酵酿造酒精。 纤维素酶是一类复合酶,含有三个主要组分。葡聚糖内切酶(endo-1,4-β-D-glucanase,EC 3 .2.1.4,简称EG),也称为Cx酶或CMCase。葡聚糖外切酶(exo-1,4 -β-D-glucanase,EC3 .2.1.91)又称C1酶。C1酶作用于纤维素线状分子末端,水解β-1, 4-糖苷键,每次切下一个纤维二糖分子,故又称纤维二糖水解酶(简称CBH)。以及β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase, EC 3.2.1.21,简称BG)。 本实验通过外显子拼接法从由中科院微生物研究所菌种保存中心购买的里氏木霉QM9414(Trichoderma sp.)的基因组DNA中分别克隆到纤维素酶组分的三个基因:葡聚糖内切酶Ⅱ基因(eg2)、葡聚糖外切酶Ⅱ基因(cbh2)和β-葡萄糖苷酶Ⅰ基因(bg1)。并成功的克隆到E.coli DH5α中扩增。 将克隆到的基因分别连接到到甲醇毕赤酵母Pichia pastoris的YIP型表达载体pPIC9K上,构建了三个诱导型表达载体pPIC9K-BG、pPIC9K-CBH和pPIC9K-EG。将pPIC9K的AOX1启动子替换成强组成型GAP启动子构建成pGAP9K载体,并将三个基因分别连接到pGAP9K上,构建了三个组成型表达载体pGAP9K-BG、pGAP9K- CBH和pGAP9K- EG。 利用电转化技术将重组表达载体pPIC9K-CBH和pGAP9K-CBH转化毕赤酵母GS115,经G418抗生素筛选得到阳性菌株GS115(pPIC9K-CBH)和GS115(pGAP9K- CBH)。在生物反应器中发酵GS115(pGAP9K- CBH),分泌表达重组CBHⅡ酶50mg/L。用CMC酶活法,测定其CMC酶活力为2.045U/mL。 本实验还通过一系列的载体改造,将Invitrogen公司提供的pSP72克隆载体改造成为了一个含有三个纤维素酶基因表达盒的载体。
【学位授予单位】:华南热带农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q78

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