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低温胁迫对香蕉幼苗生理特性的影响及冷诱导相关基因的分离

刘德兵  
【摘要】: 香蕉是世界四大粮食之一,具有很高的经济价值,是热带农业的支柱产业。我国华南产区常因寒潮入侵而导致大面积的蕉园受到毁灭性伤害,经济损失极大。培育抗寒品种一直是香蕉育种的主要育种目标之一,但是目前新选(培)育的抗寒品种,并没有从根本上解决香蕉的抗寒问题,因此,迫切要求加强香蕉抗寒机理研究,为培育抗寒香蕉新品种、降低生产上寒害损失、扩大种植面积,提供理论依据。 本研究以我国目前香蕉的主栽品种巴西蕉为试验材料,通过采用不同浓度的脱落酸(ABA)和油菜素内酯(BR)对香蕉幼苗进行预处理,然后进行程序降温到7℃并维持在7℃12个小时,然后测定电导率、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、MDA含量、SOD活性及叶绿素含量,进行香蕉幼苗植株形态、功能叶形态及叶片细胞组织结构解剖研究。对处理与对照之间的差异片段进行克隆,针对获得的克隆片段进行NCBI核酸蛋白数据库比较分析,获得与抗寒相关的克隆,运用3’-RACE和5’-RACE技术,扩增出香蕉rbcS-mc的基因全长,并对所获得的基因进行生物信息学、RT-PCR及转基因分析,获得的主要结论如下: 1、冷胁迫条件下的香蕉幼苗经浓度分别为5mg·L~(-1)、10mg·L~(-1)、15mg·L~(-1)、20mg·L~(-1)及25mg·L~(-1)的ABA及0.3mg·L~(-1)、0.6mg·L~(-1)、0.9mg·L~(-1)、1.2mg·L~(-1)及1.5mg·L~(-1)的BR处理后,相对于对照来说,在一定的处理浓度范围内,可以明显的降低电解质外渗率,提高低温胁迫下香蕉幼苗叶片中SOD的活性,一定程度上提高了低温胁迫下香蕉幼苗叶片中可溶性蛋白的含量,减缓叶片中MDA的含量变化,可溶性糖含量明显的提高,同时,明显的减缓了叶片中叶绿素降解的速度。这些代谢产物的变化,对提高香蕉幼苗冷胁迫期间的抵抗能力起着非常关键和重要的作用。保护效果最好的浓度分别是:ABA为20mg·L~(-1)、BR为0.9mg·L~(-1)。 2、7℃下培养12h后植株外部形态的变化存在明显差异,结果表明经20 mg·L~(-1)(处理A4)的ABA处理后,所试植物植株生长良好,叶色浓绿有光泽,植株健壮,冷害0级,冷害指数为4.5%,效果最好,而对照CK1经过此温度处理后有75 %的叶片完全萎蔫,其余叶片均有轻微冻伤,冷害3级,出现1株死亡,冷害指数为76%,差异显著。对于BR的不同处理来说,经0.9mg·L~(-1)的BR处理后,所试植株外观与处理A4接近,冷害0级,冷害指数为4.1%。说明施用一定浓度的BR或ABA后,可在一定程度上提高香蕉幼苗的抗寒性,但提高效果并非与ABA或BR的施用浓度呈正比。在解剖结构方面,随着冷胁迫的继续,香蕉叶片细胞组织结构紧密度呈现了较为有规律的变化,叶片厚度变薄,BR处理相对于对照来说,叶片的角质层、栅栏组织等保护组织在冷胁迫一定程度以后呈现增厚的趋势,CTR值也由CK的51.1%降低为BR处理的47.5%。 3、运用ADGE技术,克隆到在BR诱导下的低温胁迫香蕉幼苗中特异表达的18个cDNA片段并测序,在三大国际核酸数据库中进行同源性搜索,其中克隆2-1T与核酸数据库中编号为AF008214的尖叶蕉1, 5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(RuBP)羧化酶小亚基rbcS1克隆在466bp内的一致性达到99%。分别利用TaKaRa的3'- RACE及5'- RACE试剂盒,获得香蕉1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基(rbcS-mc)基因的3'和5'端序列。将3'和5'序列以及已知的克隆片断序列用DNAstar软件进行拼接得到了预计长度的一个含完全编码区的香蕉的1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基(rbcS-mc)基因序列,并进行一些生物信息学分析及对香蕉rbcS-mc基因在香蕉植株不同部位的表达情况进行了RT-PCR分析验证。RT-PCR分析结果显示该基因在香蕉植株的叶片中的表达量比叶鞘中的高,根中不表达,表明香蕉rbcS-mc基因在香蕉植株中具有组织特异性表达。 4、根据已获得的香蕉rbcS-mc基因完整ORF序列设计引物,利用香蕉rbcS-mc基因的cDNA为模板,克隆得到香蕉rbcS-mc基因ORF全长,并构建了含有完整编码区植物表达载体,转化农杆菌GV3101,通过叶盘法转化烟草植株,为进一步研究香蕉rbcS-mc基因的性质功能奠定了基础。


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