哈维氏弧菌遗传多样性分析及毒力相关基因的检测

【摘要】：哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）是海水鱼类的一种主要的病原弧菌，可以感染多种海水鱼类，在世界许多国家均有报道过该弧菌病的爆发和流行，对水产养殖业造成了巨大危害，严重的影响着海水养殖业的发展。近年来，哈维氏弧菌引发的弧菌病在我国也频繁爆发，目前已报道感染了南美白对虾、大黄鱼、红笛鲷等重要的水产经济动物。然而对哈维氏弧菌所导致的病认识时间较短，流行病学研究尚不够深入；特别是国内缺乏对哈维氏弧菌的血清型、分子型分析的研究。本实验采集了广东省、海南省、广西自治区三地的患病海水鱼类或养殖水体经分离纯化得到425株弧菌，经过分子生物学方法、再生化方法鉴定确定出101株哈维氏弧菌，对其进行命名编号；并运用血清型和分子分型（RAPD分型和BOX分型）对101株哈维氏弧菌进行分型研究以及对哈维氏弧菌毒力相关基因进行检测；主要结果如下： 1.用哈维氏弧菌对红笛鲷进行了致病性实验，发现101株哈维氏弧菌中有强毒株菌株有：1201、1203、1205、1206、1208、1213、1223、1236、1240、1243、1248、1251、1257、1260、1263、1277、1278、1279、1284、1285总计20株；弱毒株菌株有：1202、1204、1209、1215、1216、1219、1226、1227、1231、1258、1261、1264总计12株。 2.血清型结果显示初步可以将实验中的101株V.harveyi划分为两种血清型，一种是以编号1261菌株为代表，可以与前8种血清（O1208、O1261、O1250、O1203、O1223、O1277、O1279、O1205）都反应；另一种就是以编号1247菌株为代表，只与血清O1263、O1211反应；另外还有1229、1246、1255、1260、1268、1269、1271、1272、1273、1275、1278、1281、1284、1287、1288、1290、1293、1296、1299因不与制备的10种血清中的任何一种反应，故无法对其进行划分，因此有必要采用其他方法进行分型研究。 3.分子分型结果显示从10个RAPD引物中发现只有PM2引物的分辨率和重复性较好，出现15条不同RAPD条带，在相似度65%下，101株哈维氏弧菌可以分为18种不同型；BOX分型出现20条不同的条带，在相似度为40%的情况下，可以把101株哈维式弧菌分15种不同的型；综合RAPD PM2和BOX分型，发现在相似度50%下，101株哈维氏弧菌可分18种型。 4.对哈维氏弧菌toxS，zot，tcpA，tdh，trh和tlh基因的检测，结果显示：toxS基因在101株哈维氏弧菌中的检出率为17.8%，在32株毒株中检出率为25%；zot基因检出率为6.9%，在毒株中检出率为12.5%；tlh基因检出率为14.9%，在毒株中检出率为3.1%；tdh基因在检出率为7.9%，在毒株中检出率为15.6%；而tcpA和trd基因没有检测出。发现zot、trh基因在广东菌株中分布比较广泛，toxS基因在广西和广东菌株出现较频繁，tdh基因则广泛出现在海南菌株中；而tcpA、tlh在三个地区的菌株中都没有检测出。