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《广东海洋大学》 2015年
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红树林沉积物中磺胺间甲氧嘧啶(SMMX)降解菌的筛选及其降解性能研究

贺艳艳  
【摘要】:磺胺间甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine,SMMX)属于广谱、高效和高选择性的磺胺类抗生素,广泛应用于医药、畜禽与水产养殖业中的细菌、真菌或原生生物引起的感染疾病治疗。市政废水排放入海和海水养殖用药,造成抗生素类药物在包括红树林在内的滨海湿地药物残留,可能削弱微生物的分解作用从而降低生态系统的功能。本文采集了湛江观海长廊人工红树林区的沉积物样品,以筛选SMMX为单一碳源的抗生素降解细菌为目标,采用驯化方法筛选到了6株具有降解潜力的初筛菌株,运用经典和现代分子生物学方法对降解菌株进行了系统分类鉴定,同时采用超高效液相色谱仪(UPLC)检测方法结合正交试验设计在实验室内研究了降解菌株(Aeromonas caviae,HA-J1)对SMMX的生物降解性能,以获得最优降解条件,为后续构建生物修复工程菌株奠定基础。具体研究结果如下:1、应用摇瓶富集驯化的方法,通过荧光显微计数法测定驯化菌株在培养前后的数量变化,从湛江观海长廊人工红树林区的沉积物样品筛选分离到6株以兽药SMMX抗生素为单一碳源的初筛菌株,分别编号为HA-J1、HA-J4、HA-J5、HA-J7、HA-J8和HA-J9。在相同培养条件下,随兽药浓度的增大6株菌的数量先增加后减少,在800mg/L时,生长最适宜。通过生长曲线测定,菌株在15~24h处于生长旺盛的阶段,可以作为测定生物降解量末端的合适取样时间。2、根据细菌形态学观察、生理生化试验和细菌16s rDNA扩增对6株SMMX降解菌进行了系统分类鉴定,结果表明,HA-J1、HA-J4、HA-J5、HA-J8为气单胞菌属(Aeromonas),HA-J7、HA-J9为克雷伯氏菌属(Klebsiella),再分别通过看家基因gyr B/gyr A基因进一步鉴定,结果表明HA-J1、HA-J4、HA-J5、HA-J8为豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae),HA-J7、HA-J9为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。3、通过在无机盐培养液中添加色谱纯SMMX室内摇瓶培养研究6株降解菌进行浓度递增复筛,采用UPLC测定降解菌培养前后的SMMX的降解率,结合荧光显微镜测定培养前后SMMX降解菌的数量变化,获得复筛结果,6株菌HA-J1、HA-J4、HA-J5、HA-J7、HA-J8与HA-J9的有效生物降解率依次为24.13%、6.8%、1.4%、4%、13%、3.75%,由此将HA-J1菌株确定为SMMX高效生物降解菌株。通过Pearson相关性分析6株初筛菌对磺胺间甲氧嘧啶降解率与降解前后细菌的增量,发现相关性不显著(p0.05)。4、通过正交试验设计测定了HA-J1菌株在不同pH值、温度、盐度、SMMX浓度的四因素五水平的25组实验组合条件下对SMMX降解率及降解菌数量变化,获得HA-J1菌株最优降解条件组合为温度25℃、pH5、盐度为15、抗生素浓度为200mg/L,最优组合条件下的生物降解率达14.47%。多因素方差分析结果显示各因素间无显著性差异(p0.05)。通过Pearson相关性分析,发现各组合下的降解率与降解前后的细菌增量有显著的正相关(r=0.735,p0.05)。在最优正交组合下测定细菌最佳接种量为16%,降解率为19.29%。5、为探讨降解菌株对其他磺胺类药物的降解性能,研究了6株初筛菌株在相同培养条件下分别在以100mg/L的磺胺间甲氧嘧啶(SMMX)和磺胺甲噁唑(SMX)为单一碳源的无机盐培养液中的生物降解效率,HA-J1、HA-J4、HA-J5、HA-J7、HA-J8与HA-J9对SMMX的有效生物降解率依次为14.11%、1.55%、1.47%、4.87%、8.49%、3.33%,对SMX的生物降解率分别为0.64%、0.32%、0.47%、0.45%、0.14%。配对T检验结果表明,降解菌对SMX的降解率显著低于其对SMMX的降解率(p0.05)。6、研究了添加100mg/L的葡萄糖、甲醇、蔗糖等不同碳源后高效降解菌株HA-J1对相同质量体积浓度SMMX抗生素(即也为100mg/L)的降解率,结果表明,添加葡萄糖、甲醇、蔗糖这三种碳源后的降解效率依次分别为23.02%、18.36%、14.61%,无外加碳源的对照组降解率为13.45%。添加外加碳源不同程度的提高了高效降解菌株对SMMX的降解率,但两者之间无显著差异(ANOVA,p0.05)。本文的研究结果表明从红树林区沉积物中可以筛选得到高效降解磺胺类药物磺胺间甲氧嘧啶的单一菌株,并鉴定为豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae),但其降解功能基因及降解途径尚不清楚,还有待于进一步研究。
【学位授予单位】:广东海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:X172

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