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《广东海洋大学》 2017年
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南极磷虾蛋白源二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-Ⅳ)抑制肽的研究

吉薇  
【摘要】:糖尿病已成为继恶性肿瘤、心血管之后,第三大严重威胁人类健康和生命的代谢性疾病,它能引发脑血管疾病、冠心病、视网膜病变等多种并发症,甚至死亡。目前,糖尿病的控制与治疗主要是依靠食物控制和药物。治疗糖尿病的药物主要是人工合成的药物,它们都有一定的毒副作用。肠促胰岛素药物中的DPP-Ⅳ抑制肽无论是从有效性还是安全性,对糖尿病都具有较好的疗效。来源于食品蛋白的DPP-Ⅳ抑制肽具有来源广泛、安全性高、降血糖效果好等优点,已成为关注和研究的热点。南极磷虾生物量大,潜在资源蕴量约6亿吨。蛋白质含量高,单只虾的蛋白含量约为70.58%(干基),富含人体所需的20种氨基酸,是制备DPP-Ⅳ抑制肽的良好资源。本论文以南极磷虾为原料,研究DPP-Ⅳ抑制肽的制备、分离纯化、活性评价与作用机制,为南极磷虾开发降血糖功能食品配料提供技术依据,主要研究内容与结果如下:1、以DPP-Ⅳ抑制率为主要评价指标,采用动物蛋白酶水解南极磷虾,首先考察了时间、温度、pH、酶添加量4个单因素对南极磷虾酶解产物DPP-Ⅳ抑制率和可溶性蛋白的影响,然后以采用响应面法对这4个因素进行了优化。结果表明,南极磷虾制备DPP-Ⅳ抑制肽最佳工艺参数为:酶解时间3.85h、温度45℃、pH值7.6、酶添加量237.6U/g,在此条件下DPP-Ⅳ抑制率为64.82%。2、以荧光底物法(试剂盒法)测定的DPP-Ⅳ抑制率为评价指标,采用醋酸钙沉淀法对南极磷虾酶解液进行脱氟处理,然后采用截留分子量分别5000Da,3000Da,100Da的超滤膜对其进行超滤分离,分子量为3000-100Da的超滤组分显示了较高DPP-Ⅳ抑制活性,它在Sephacryl S-100凝胶色谱柱上被分离为3个组分(F1,F2,F3),其中高活性组分F1采用反相高效液相色谱进一步纯化,获得了3个肽(F1-1,F1-2,F1-3);纯化的肽通过氨基酸分析仪和三重四级杆飞行时间质谱(QTOF-MS)鉴定DPP-Ⅳ肽的氨基酸序列。结果表明,它们分别为Ala-Pro(AP)、Ile-Pro-Ala(IPA)和Ile-Pro-Ala-Val-Phe(IPAVF),DPP-Ⅳ抑制肽的IC50分别为0.0530mg/m L,0.0370mg/mL和0.0730mg/mL。3、采用固相合成法合成AP、IPA和IPAVF,采用HPLC与质谱法对其身份进行证实,结果表明:合成的3种肽与从南极磷虾中纯化到的3种DPP-Ⅳ抑制肽具有相同的氨基酸序列,且纯度较高;通过联合20g/L葡萄糖溶液浸泡和10%胆固醇喂养20天的方法,快速建立了稳定的糖尿病斑马鱼模型。并用该模型对AP、IPA和IPAVF进行体内活性评价,评价的理化指标为DPP-Ⅳ活性、葡萄糖、甘油三酯、胆固醇,基因指标为Insa、Glucagon、Pck1基因。结果表明,AP、IPA和IPAVF对糖尿病斑马鱼都有一定的降血糖功效,且多肽浓度与降血糖效果呈正相关关系。在3种肽中,IPA的降血糖效果最好。4、3种DPP-Ⅳ抑制肽(AP、IPA、IPAVF)对DPP-Ⅳ的抑制动力学进行了研究。结果表明:AP、IPA和IPAVF对DPP-Ⅳ抑制类型均为竞争性可逆性抑制;运用计算机软件模拟和分子对接方法,考察了AP、IPA和IPAVF 3个DPP-Ⅳ抑制肽与DPP-Ⅳ的相互作用,模拟出IPA-DPP-Ⅳ、IPA-DPP-Ⅳ和IPAVF-DPP-Ⅳ三个对接模型,其中IPA与DPP-Ⅳ对接最好,表明IPA对DPP-Ⅳ抑制作用效果最佳,IPA与DPP-Ⅳ对接的主要结合部位在91-96和101-105号氨基酸残基。5、以理化指标(DPP-Ⅳ活性、葡萄糖、甘油三酯、胆固醇)和相关基因(Insa、Glucagon、Pck1)表达水平为考察指标,采用糖尿病斑马鱼模型对3000-100Da南极磷虾酶解物进行了降血糖功效评价。综合理化指标和基因指标的测定结果,得出以下结论:1.35g/L和2.7g/L浓度的3000-100Da AKH的降血糖功效不是很明显。5.4g/L浓度的3000-100Da AKH具有一定的降血糖功效,但不及AP、IPA和IPAVF。
【学位授予单位】:广东海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R587.1;TS254.1

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