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《广东海洋大学》 2018年
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Izumo1基因在斑马鱼精卵识别和融合过程中的功能研究

杜文文  
【摘要】:生物体的生殖包括有性生殖和无性生殖两种。在有性生殖过程中,受精作用涉及到一系列复杂精密的过程,其中精、卵细胞膜的识别与融合是受精过程中非常关键的一步,是有性生殖生命发生的第一个过程。因此,明确其分子机制对理解生命个体的发生意义重大!精卵识别与融合过程涉及到大量的精、卵细胞膜上的蛋白。目前,科学研究者们在精子和卵子细胞膜表面发现了许多与精、卵细胞融合相关的蛋白分子,在这些已获得的蛋白分子中,位于精子细胞膜上的IZUMO1蛋白已经被证明是精、卵细胞融合的关键分子。近年来,斑马鱼(Barchydanio rerio var)因其特有的优势及其生物学特性,已经成为脊椎动物中一种新型的模式生物,广泛应用于分子生物学、环境毒理学等方面的研究。因此本研究以斑马鱼为研究对象,拟通过对斑马鱼Izumo1基因的研究,为鱼类的受精机制提供理论基础。本文以斑马鱼作为研究对象,开展了对与精卵识别与融合过程相关的Izumo1基因的研究,进行了Izumo1基因的克隆、组织表达、真核表达载体的构建以及胚胎的显微注射等工作。结果如下:采用RT-PCR技术克隆了斑马鱼Izumo1基因的c DNA,并通过生物信息学软件对其序列以及编码的蛋白质进行分析。结果表明:克隆得到的斑马鱼Izumo1基因c DNA的全长是1112 bp,开放阅读框(ORF)为1011 bp,编码336个氨基酸,含有信号肽序列和一次跨膜螺旋区,脂肪系数高达97.98,亲水性总平均值(GRAVY)为-0.233,预测显示该蛋白有IZUMO结构域以及免疫球蛋白超家族结构域,三级结构预测结果显示其空间结构与人和小鼠的Izumo1蛋白的空间结构相似,蛋白质系统进化分析显示,IZUMO1蛋白在同一目内的动物间具有很高的相似性。采用RT-PCR技术,对斑马鱼Izumo1基因在各组织中的表达情况进行分析。结果表明,Izumo1基因仅在雄性斑马鱼的精巢组织中特异性表达,而在其它组织中未检测到该基因的表达。这说明斑马鱼Izumo1基因表达具有组织特异性,推测其与斑马鱼受精作用有关,可能参与精卵细胞的识别与融合过程。使用搭桥PCR成功获得了来源不同的Izumo1基因和T2A的融合基因,并以此作为目的基因,先后成功构建出了CMV-IZUMO1-2A-RFP和SP6+ZIZUMO+2A+RFP+SV40 poly A真核表达载体,并通过体外转录方法将SP6+ZIZUMO+2A+RFP+SV40 poly A真核表达载体体外转录成m RNA进行显微注射1细胞期斑马鱼胚胎。将在囊胚期成功表达IZUMO1蛋白的胚胎消化处理,发出荧光的细胞能与去除受精膜(chorion)的卵母细胞膜结合,推测IZUMO1蛋白在卵母细胞上有其受体存在,IZUMO1蛋白可能参与精、卵细胞的识别与融合。对于Izumo1基因在受精过程中的分子机制还有待于进一步的研究,目前实验室已成功建立了P0代Izumo1基因基因敲除的斑马鱼和斑马鱼卵母细胞膜体系酵母双杂交均一化文库,以便进一步研究Izumo1基因在斑马鱼受精过程中的功能和寻找与IZUMO1蛋白相互作用的卵母细胞膜上的受体蛋白。
【学位授予单位】:广东海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S917.4

【参考文献】
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