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《广东海洋大学》 2017年
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抗阿尔茨海默症相关活性海藻和海洋真菌的筛选及其次级代谢产物的研究

聂影影  
【摘要】:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年痴呆的主要类型,AD的发病机理复杂多样,其中,氧化应激假说和胆碱能缺失假说与AD的产生及发病症状密切相关,较受重视。基于这两种假说的天然来源的抗AD药物主要集中在植物和陆生微生物,有关海藻的乙酰胆碱酯酶抑制活性的研究报道不多,而海洋真菌来源的抗AD相关活性的研究也相对滞后。海藻和真菌作为海洋生物类群的重要组成部分,为防治阿尔茨海默症活性先导化合物提供了新颖资源,亟待开发。本研究基于这两种假说,采用乙酰胆碱酯酶(ACh E)抑制活性-1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除活性组合筛选模型,利用TLC筛选法、96孔板筛选法和卤虫致死法对实验室来自湛江等海域的10种海藻和35株海洋真菌进行筛选和毒性评价,得到5株海洋真菌和2种海藻的提取物浓度为200μg/m L时ACh E抑制率大于阳性对照他克林(89.8%),有4种海藻和6株海洋真菌同时具有ACh E抑制活性(200μg/m L时的抑制率大于20%)和DPPH自由基清除活性(200μg/m L时的DPPH清除率大于30%),卤虫致死率分别为:海洋真菌提取物小于12%,海藻提取物小于50%。其中,尚未发现团扇藻(Padina sp.)具有抗阿尔茨海默症相关活性的报道。运用活性偶联的HPLC分析法对其中活性斑点多样性高或差异性大且毒性小的4株海洋真菌C21-1(Penicillium sp.)、C23-3(Aspergillus sp.)、DLEN2008005(Trichoderma harzianum)、TBG1-17(Penicillium corylophilum)和两种海藻(羊栖菜Hizikia fusifarme、团扇藻)的提取物进行活性追踪,从而为后续的分离纯化工作提供指导。筛选结果表明,菌株C23-3的ACh E抑制活性和DPPH自由基清除活性最强,并且活性斑点多样性高。菌株C21-1的ACh E抑制活性斑点明显区别于其他菌株。且海洋真菌的活性明显高于海藻,因而选取菌株C23-3和C21-1进行大量发酵。利用Sephadex LH-20柱、ODS柱及HPLC等手段从C23-3的发酵粗提物中获得3个单体化合物,包括1个抗氧化剂丁内酯Ⅰ(NYY-1),1个抗癌剂土曲霉酮(NYY-2)和1个ACh E抑制剂土震素B(NYY-3);从C21-1的发酵粗提物中获得2个单体化合物,1个广谱抗菌剂(R)-(–)-hydroxysydonic acid(LYM-1)和1个ACh E抑制剂homodimeric WIN 64821(XMX-1),目前尚未发现化合物homodimeric WIN 64821具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的文献报道。并从C23-3发酵物中分离获得3个ACh E抑制强活性粗组分F5、F7和F8,其IC50分别为0.5、13.1和0.63μg/m L;3个DPPH抗氧化中等强度活性粗组分F6、F8和F9,其EC50均小于100μg/m L。由于菌株C23-3活性斑点多样性高,成分复杂,但很多活性产物产量较低。考虑到小分子化学诱导剂常可通过激活某些沉默基因,提高代谢产物产量和多样性,因此本实验室尝试采用组蛋白脱乙酰化酶抑制剂(丁酸钠和SAHA)、DNA甲基化抑制剂(5-氮杂胞苷和普鲁卡因)、无机盐(Zn Cl2和Cu Cl2)共6种化学诱导剂对该菌株进行表观遗传修饰,以进一步提高目的代谢产物的产量和多样性。对比诱导前后C23-3表观形态变化,运用TLC显色特征和HPLC对其代谢产物进行分析,结果表明,经过伏立诺他(SAHA,100μM)、Zn Cl2(100μM)、丁酸钠(100μM)诱导之后的次级代谢产物中活性组分的产量均有提高,并且SAHA和Zn Cl2诱导组产生了具有抗AD相关活性的新物质。本论文通过筛选,总共得到4种海藻和6株海洋真菌同时具有ACh E抑制活性和DPPH自由基清除活性,并且具有较低的卤虫毒性;从普哥滨珊瑚内生菌C21-1和牡丹珊瑚内生真菌C23-3的发酵产物中分离纯化共得到3个具有抗AD相关活性的单体化合物,包括2个ACh E抑制剂(土震素B和homodimeric WIN 64821)、1个抗氧化剂(丁内酯Ⅰ);并且,采用小分子化学诱导来进行表观遗传修饰的方法,明显提高了菌株C23-3次级代谢产物中丁内酯Ⅰ的产量。
【学位授予单位】:广东海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R282.77

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