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《广东海洋大学》 2019年
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副溶血性弧菌在六种食品中致病力的差异及与肠道菌群的关联性研究

王润东  
【摘要】:副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是一种海洋源致病菌,常从海产品中检出,然而,由于食品生熟加工不规范等,极易导致淡水鱼类、畜禽肉类和鸡蛋制品的交叉污染,特别是造成了误食者不同程度的食物中毒。Vp中毒症状的差异与其致病力的变化相关,目前已经清楚该菌的致病力来源于菌体和有毒代谢物的作用。但是,不同食品中Vp致病力的变化规律及体内的致病机制仍不清楚。因此,本文从以下四方面开展研究,具体内容和结果如下:1、体外试验考察Vp在六种食品中生长和产毒的规律Vp接种到对虾、牡蛎、淡水鱼、猪肉、鸡肉和蛋炒饭中培养后,采用菌落计数、血平板法、相对溶血活度法、q-RT-PCR和胞外酶检测,分别测定六种食品中Vp的菌量、TDH活性、总溶血活性、溶血素基因表达和胞外酶活性。结果表明,Vp在对虾、牡蛎、淡水鱼和蛋炒饭中的生长速率明显高于猪肉和鸡肉,但生长稳定期各食品中Vp菌量均达到10~9 CFU/g。Vp在对虾、牡蛎、淡水鱼和蛋炒饭中培养6-12 h内,总溶血活性随时间呈线性增长,速率常数均大于0.052;而在猪肉和鸡肉中线性增长范围为6-18 h,速率常数均为0.023;线性增长后,Vp在各食品中总溶血活性均达到最大值且保持稳定。培养终点,Vp在蛋炒饭中tdh和tlh基因上调幅度最大,因此具有最高的TDH活性和总溶血活性,其次为对虾淡水鱼鸡肉牡蛎猪肉。然而,胞外酶活性规律与溶血活性并非完全一致,Vp在对虾中明胶酶、酪蛋白酶、DNA酶、脲酶和磷脂酶的综合活性最高,随后为淡水鱼鸡肉牡蛎猪肉蛋炒饭。2、体内试验考量Vp在六种食品培养后对小鼠致病力的差异采用小鼠攻毒试验,观察并测定六种食品培养的Vp感染小鼠后的临床症状、死亡率、血常规、肝肾功能及脏器系数。结果表明,攻毒48 h内对虾、淡水鱼和鸡肉组的小鼠最先出现行动迟缓、被毛蓬松和死亡等症状,且各组的小鼠死亡率分别为41.7%(对虾)、16.7%(牡蛎)、33.3%(淡水鱼)、0%(猪肉)、25%(鸡肉)、8.4%(蛋炒饭)。对虾、淡水鱼和鸡肉组小鼠的白细胞(WBC)、红细胞(RBC)和血红蛋白含量均显著降低(p0.05),血小板含量上升(p0.05)。其中对虾组变化幅度最大,分别为-64.2%、-45.4%、-18.7%和48.6%。牡蛎、猪肉和蛋炒饭组WBC和RBC含量降低(p0.05)。对虾组小鼠的尿素氮(BUN)、碱性磷酸酶(ALP)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)均显著增加(p0.05),分别为191.7%、208.5%、109.1%、200%;牡蛎、淡水鱼和鸡肉组除ALP未升高,其他指标均显著升高(p0.05),但幅度小于对虾组,猪肉和蛋炒饭组ALT和AST升高(p0.05)。各组小鼠的肠系数均显著上升(p0.05),尤其在对虾和淡水鱼组胃和肝系数特异性增加。综合比较,六种食品培养的Vp对小鼠的致病力存在明显差异,致病力强弱顺序为:对虾淡水鱼鸡肉蛋炒饭牡蛎猪肉。3、自主构建伪无菌小鼠模型考证肠道菌群与Vp在体内致病的相关性采用灌胃正常小鼠混合抗生素的方法,剔除肠道菌群,构建伪无菌小鼠模型。再将Vp菌悬液分别攻毒伪无菌小鼠和正常小鼠,比较两组小鼠的肠道损伤、机体炎症和肝肾功能差异。结果表明,具有完整肠道菌群的小鼠的肠壁出血和黄色粘液量明显多于伪无菌小鼠,且正常小鼠血清炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和抑炎因子IL-10平均变化幅度为伪无菌小鼠的2.5倍,肝肾功能指标ALT、AST、ALP和BUN的平均变化幅度为伪无菌小鼠的1.6倍。正常小鼠受到Vp感染后,出现肠道损伤、机体炎症和肝肾功能恶化,其程度均比伪无菌小鼠严重。首次发现肠道菌群参与Vp在体内的致病。4、宏基因组16S rDNA测序技术考究与六种食品中Vp致病力关联的目标菌群针对六种食品培养的Vp感染小鼠,采用宏基因组16S rDNA测序法,通过多样性参数、物种丰度变化、主坐标分析和预测群落功能等,识别与六种食品中Vp致病力关联的目标菌群。结果表明,小鼠被六种食品培养的Vp感染后,肠道菌群α多样性指数Shannon、Chao1和Ace指数及物种分类单元OTU均显著降低(p0.05),菌群结构明显改变。在门水平,六种食品的感染组较对照组肠道内拟杆菌门比例显著降低而厚壁菌门和变形菌门比例明显升高。在属水平,与对照组相比,六种食品的感染组小鼠肠道内Bacteroides、Lactobacillus、Bifidobacterium、Rikenellaceae和Lachnospiraceae比例显著降低,而Enterococcaceae、Streptococcus、Clostridiales和Vibrio比例明显升高。尤其是在强致病力的对虾、淡水鱼和鸡肉感染组小鼠肠道内益生菌、产丁酸和短链脂肪酸相关的Akkermansia、Ruminococcaceae和Faecalibacterium比例特异性减少,而促进炎症和肝损伤的Prevotella和Sutterella比例增加,不同食品感染组之间存在不同的Biomarker菌。在Metastats分析的基础上,进一步应用PICRUSt群落功能预测程序挖掘发现肠道菌群的新陈代谢、遗传信息处理和弧菌感染功能在各食品感染组均显著改变,然而,侵袭上皮细胞途径、cAMP信号通路和胆汁酸合成功能仅在对虾、淡水鱼和鸡肉感染组改变,六种食品中Vp的致病强弱与其诱导的小鼠肠道菌群结构差异和群落功能改变密切关联。综上所述,本研究在探明六种食品中Vp生长、产毒及对机体损伤差异的基础上,利用自主构建的伪无菌小鼠模型阐明宿主肠道菌群促进Vp的致病,进一步经宏基因组学16S rDNA测序挖掘到与Vp在体内致病力相关联的标志菌群和重要群落功能,为Vp污染不同食品后的风险评估及其在体内致病机制的解析提供理论依据。
【学位授予单位】:广东海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:TS201.3

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