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罗非鱼CD6分子及其相关配体的鉴定与功能研究

汪志文  
【摘要】:哺乳动物中,CD6分子作为来自清道夫受体家族的一种淋巴细胞特异性表面受体,在抗炎症反应以及T细胞激活中具有重要作用,兼顾先天性免疫和适应性免疫调控。但是,CD6分子在以硬骨鱼类为代表的低等脊椎动物中的特性和功能尚不清楚。为探究鱼类CD6分子功能,本论文以尼罗罗非鱼为对象克隆鉴定了CD6分子(On CD6)及其配体CD166、Syntenin-1、LCP2和TARF6。由此展开了以下4个方面的工作:(1)通过原核表达获取了On CD6胞外段蛋白,制备单克隆抗体,探究了On CD6分子富含半胱氨酸结构域胞外段蛋白的生物学功能;(2)以罗非鱼头肾淋巴细胞和动物实验探究了On CD6分子参与炎症反应的作用机制;(3)通过GST Pull-Down确定了On CD6分子与其配体的互作及互作结构域(4)初步探究了On CD6分子及其配体参与的信号通路。取得的研究结果如下:1、On CD6分子作为清道夫受体具备模式识别受体的功能本研究成功克隆鉴定了罗非鱼CD6基因,该分子定位于淋巴细胞膜上。体外实验表明On CD6分子胞外段重组蛋白On CD6-ECD在Ca~(2+)作用下能够广泛识别各种水产病原菌以及病原体相关分子模式(PAMPs),具有体外抑菌功能并能够诱导细菌凝集,能够促进头肾淋巴细胞的呼吸爆发作用和吞噬反应,并促进HKLs促炎因子IL-1β和TNF-α和抑炎因子IL-10和TGF-β的表达。而其配体CD166则不需要在Ca~(2+)的存在下就能够广泛识别病原体相关分子模式。这些结果表明CD6分子作为清道夫受体的功能保守存在从而具有模式识别受体分子(PRRs)的功能。2、On CD6分子参与无乳链球菌引起的罗非鱼急性炎症反应的作用机制On CD6-ECD重组蛋白联合无乳链球菌攻毒以及On CD6在体内过表达后攻毒实验都能有效提高罗非鱼对无乳链球菌感染的免疫保护率。进一步探究发现On CD6能够有效降低无乳链球菌在罗非鱼体内的定植,并增强鱼体总抗氧化能力、抑制促炎因子IL-1β和TNF-α的表达、促进抑炎因子IL-10和TGF-β的表达。通过细胞信号通路抑制剂刺激HKLs,发现On CD6分子可能通过NF-κB、MAPK通路调节炎症因子的表达。结合体外研究结果,发现On CD6参与炎症反应的可能机制:广泛识别各种病原体相关分子模式从而结合各种病原引起细菌凝集,增大外源病菌颗粒大小,提高抗氧化物酶活性增强呼吸爆发作用,促进对细菌的清除作用(吞噬作用)。与此同时下调促炎因子IL-1β和TNF-α表达,促进抑炎因子IL-10和TGF-β的表达,降低由无乳链球菌感染造成的损伤等炎性反应症状,从而有效保护机体。3、On CD6分子胞内胞外相关配体表达特征及互作确定成功克隆获取CD6胞内胞外相关配体CD166、Syntenin-1、LCP2和TRAF6。相关定量实验结果表明On CD6分子及其配体组织表达特征具有一致性,都在免疫相关组织中高水平表达,且在LPS、LTA和无乳链球菌刺激下快速上调表达,表明On CD6分子及其配体参与了罗非鱼对无乳链球菌免疫应答;KLH刺激结果表明On CD6在KLH刺激之后,逐渐增加,并且在二次免疫后呈现表达更快,强度更高和持续时间更长的时序表达模式,我们推测On CD6可能参与了宿主对T细胞依赖性病原体感染的防御。GST Pull-Down和ELISA实验结果表明,On CD6与胞外配体On CD166能够结合,并且相互作用结构域为On CD6-SR_2和On CD166-IG_1;GST Pull-Down体外验证了罗非鱼CD6胞内段CD6-ICD与On Syntenin-1、On LCP2能够结合,而On CD6与On TRAF6的结合可能是通过On Syntenin-1间接作用。4、On CD6、On CD166和On TRAF6参与的信号通路本研究中On CD6和On CD166抑制NF-κB通路激活,On TRAF6显著激活该通路。将On CD6/On CD166和On TRAF6共转染后发现,On CD6/On CD166下调TRAF6引起的NF-κB激活,表明On CD6可能通过与TARF6的结合参与NF-κB的负调节;此外,On CD6/On CD166有效激活了STAT1和ISRE干扰素激活反应元件,并最终激活了IFN3的表达,对IFN1的影响没有显著性变化。我们推测On CD6与其配体的相互作用,可能在IFN3的激活过程中具有重要作用,从而在抗病毒反应中也具有一定作用。


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