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乙型肝炎HBVcccDNA跨单缺口和跨双缺口实时定量PCR检测方法

肖春花  
【摘要】:全世界超过4亿人感染乙型肝炎病毒,其中导致死亡的主要原因是乙型肝炎慢性化感染。现在,很多抗病毒药物通过治疗疗程可以使病毒降至检测水平以下,但停药后很容易复发,闭合环状DNA(cccDNA)被认为是导致复发的主要原因。因此,监测cccDNA的变化水平对治疗乙型肝炎显得非常重要。但是目前没有非常成熟的HBVcccDNA荧光定量PCR检测方法,更缺乏一种快速、准确、特异性和灵敏度高、成本低、易操作的检测方法。究其原因是各检测方法都不同程度的存在假阳性问题,主要来自RcDNA的干扰。目前主要的检测方法有三种,即侵入者探针法(Invader assay)、嵌合引物荧光定量PCR法、选择性荧光定量PCR法,但不管是那种检测方法,其策略都是利用cccDNA与RcDNA结构连续性差异而实现检测的特异性。前两者即无法排除高RcDNA背景下的影响也不能清除非规范复制造成的干扰;后者包括两种:跨单缺口的特异引物及标有荧光素的TaqMan特异探针、跨双缺口的特异引物及标有荧光素的Hybridization特异探针。单纯的跨单缺口荧光定量PCR检测方法因不能排除非规范复制(生成双链线性DNA)及高RcDNA背景造成的干扰而被认为特异性比较低,但目前许多HBVcccDNA荧光定量PCR检测试剂盒就是应用了跨单缺口的特异引物及TaqMan探针技术,也有不少的文献报道使用这种试剂盒检测HBVcccDNA含量,进一步研究cccDNA与HBV-DNA等的相关性或用来评价某种抗病毒药物对HBVcccDNA的清除作用。跨双缺口的荧光定量PCR法能排除非规范复制造成的干扰,但不能完全排除高RcDNA背景下的干扰。许多学者采用Plasmid-safe ATP-dependent DNase消化总DNA抽提产物,能有效降解RcDNA和线性DNA。目前国外许多学者比较认可的HBVcccDNA检测方法是使用Plasmid-safe ATP-dependent DNase进行消化,并设计HBVcccDNA跨双缺口的荧光定量PCR法。但此方法也有其缺陷:PCR产物较大,在探针选择方面受到限制,常用技术要求高、操作复杂、成本高、使用受限的杂交探针(Hybridization probe),而不能选择目前最为成熟、稳定、易操作和成本低的TaqMan探针。 目的检测Plasmid-safe ATP-dependent DNase去除RcDNA、线性DNA造成干扰的效果;建立一种快速、准确、灵敏度高、成本低、易操作的HBVcccDNA跨单缺口荧光定量PCR检测方法(TaqMan探针)。为证实此方法的特异性,用此方法的检测结果与建立的HBVcccDNA跨双缺口荧光定量PCR检测方法的检测结果进行比较。 方法利用RcDNA与cccDNA在结构和理化性质上存在的差异,建立检测HBVcccDNA病毒载量的跨单缺口(TaqMan探针)和跨双缺口(Hybridization探针)两种荧光定量PCR检测方法。分别提取同一患者的血清和肝组织中的总DNA,部分抽提产物用DNase消化处理,经或未经DNase消化处理的样本均用HBVcccDNA跨单缺口荧光定量PCR和跨双缺口荧光定量PCR方法检测。分别回收HBVcccDNA跨单缺口荧光定量PCR和跨双缺口荧光定量PCR的PCR产物,对产物进行克隆、筛选、测序和分析,并使用SPSS13.0统计软件分析未经Plasmid-safe ATP-dependent DNase(简称为DNase)消化的HBVcccDNA跨单缺口荧光定量PCR、经DNase消化的HBVcccDNA跨单缺口荧光定量PCR和跨双缺口荧光定量PCR三种PCR检测方法的检测结果之间是否存在统计学差异。 结果成功建立了HBVcccDNA跨单缺口荧光定量PCR检测方法(TaqMan探针)和跨双缺口荧光定量PCR检测方法(Hybridization探针)。未经Plasmid-safe ATP-dependent DNase(简称为DNase)消化的HBVcccDNA跨单缺口荧光定量PCR、经DNase消化的HBVcccDNA跨单缺口荧光定量PCR和跨双缺口荧光定量PCR三种PCR检测方法的检测结果之间存在统计学差异,表现为:血清和肝组织中经DNase消化后的HBVcccDNA拷贝数比未经DNase消化的拷贝数均显著降低,血清Z=-3.920,P0.000,肝组织Z=-3.920,P0.000;血清或肝组织经DNase消化后,其跨双缺口荧光定量PCR的HBVcccDNA拷贝数比跨单缺口荧光定量PCR的拷贝数均显著降低,血清Z=-3.296,P=0.001,肝组织Z=-3.808,P0.000;血清中未经DNase消化的HBVcccDNA跨单缺口荧光定量PCR、经DNase消化的HBVcccDNA跨单缺口荧光定量PCR和跨双缺口荧光定量PCR的拷贝数均比肝组织的相应实验结果显著降低,P0.001。 结论Plasmid-safe ATP-dependent DNase能够有效降低HBVcccDNA检测方法的假阳性问题,但不能完全消除RcDNA、线性DNA等的干扰;成功建立了HBVcccDNA跨单缺口荧光定量PCR检测方法(TaqMan探针)和HBVcccDNA跨双缺口荧光定量PCR检测方法(Hybridization探针);合用DNase消化处理样本的HBVcccDNA跨单缺口荧光定量PCR的特异性不如合用DNase消化处理样本的HBVcccDNA跨双缺口荧光定量PCR高,即HBVcccDNA的跨双缺口荧光定量PCR特异性高于HBVcccDNA的跨单缺口荧光定量PCR。


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