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《广州医学院》 2010年
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左旋紫草素通过抑制蛋白酶体活性抗肿瘤作用的体内外研究

黄洪标  
【摘要】:背景与目的 泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)是细胞内主要的蛋白质降解系统,介导了细胞内多种蛋白的降解,参与细胞重要生命过程的调节。蛋白酶体本身已成为包括抗肿瘤在内多种疾病的重要靶点,因此寻找有效的蛋白酶体抑制剂也随之成为众多学者研究的热点。我国具有丰富的中草药资源,从中药单体中筛选具有抑制蛋白酶体活性的药物具有广阔前景。本实验室运用已建立的的蛋白酶体抑制剂筛选平台,对中草药单体化合物进行粗筛,发现左旋紫草素在体外能明显抑制蛋白酶体活性。本研究在实验室前期工作基础上拟进一步探讨左旋紫草素在不同细胞系诱导细胞死亡及在体抗肿瘤作用与其抑制蛋白酶体功能之间的关系。 方法与结果 1、左旋紫草素对稳定转染的GFPu-HEK293细胞内蛋白酶体的抑制作用选用稳定转染GFPu的HEK293细胞为研究对象,加入不同剂量(0-8μmol/L)左旋紫草素作用8小时收集细胞,裂解细胞抽提总蛋白进行western blot蛋白测定。SDS-PAGE电泳根据已报道的方法进行。采用ECL-plus测定试剂及KodaK公司生产的X曝光成像系统对实验结果进行采集。结果表明:反映UPS系统功能的内源性蛋白Ub、外源性蛋白GFPu在不同浓度左旋紫草素作用下开始出现聚集,并呈浓度依赖关系。 2、左旋紫草素诱导P388细胞死亡与其抑制细胞蛋白酶体活性关系的研究采用小鼠白血病P388细胞为研究对象,加入不同浓度的左旋紫草素(0-6μmol/L)作用6小时及相同剂量(2μmol/L)作用不同时间(0-12h)后,裂解细胞抽提总蛋白测定细胞蛋白酶体活性,发现左旋紫草素能明显抑制P388细胞内蛋白酶体活性,且呈浓度和时间依赖关系。同等条件下用Annexin V-FITC染色流式细胞术检测细胞的死亡情况,发现左旋紫草素诱导P388细胞死亡呈浓度和时间依赖关系。抽提总蛋白进行western blot检测内源性蛋白Ub,凋亡相关蛋白PARP,结果显示左旋紫草素引起明显的泛素化蛋白聚集和PARP的切割存在浓度和时间依赖的关系,且蛋白酶体抑制发生在细胞死亡之前。 3、左旋紫草素对腹水瘤小鼠生存时间的影响 实验选择P388腹水瘤昆明小鼠为研究对象,小鼠腹腔接种肿瘤细胞24小时后开始给予腹腔注射剂量为4mg/kg的左旋紫草素,每天一次,持续给药7天,观察小鼠生存时间,连续观察60天。结果显示4mg/kg左旋紫草素能明显延长P388腹水瘤小鼠生存时间,溶剂对照组在23天内小鼠全部死亡,而给药组第28天死亡一只,其余小鼠都存活到实验结束(60天)。 4、左旋紫草素对实体瘤小鼠抑瘤作用与其抑制蛋白酶体功能之间的关系 实验选择小鼠肝癌细胞H22实体瘤昆明小鼠为研究对象,小鼠左腋皮下接种肿瘤细胞24小时后开始给予腹腔注射剂量为4mg/kg和8mg/kg的左旋紫草素,每天一次,持续给药7天,第九天剥取肿瘤组织,称重,提取肿瘤组织总蛋白用western blot检测反映UPS系统功能的内源性蛋白Ub、Hsp70、IkBα、Bax、P27,同时中性甲醛固定肿瘤组织用免疫组化法检测P27,TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况。结果显示4mg/kg和8mg/kg的左旋紫草素能明显抑制在体肿瘤生长,抑瘤率分别达到42.4%和55.9%,western blot检测显示给药组肿瘤组织内反映UPS系统功能的Ub、Hsp70、IkBα、Bax、P27都出现了聚集,免疫组化同样显示肿瘤组织内P27蛋白聚集,凋亡细胞增加。 结论 1、左旋紫草素能抑制细胞内蛋白酶体活性,引起内源性和外源性蛋白酶体底物蛋白聚集。 2、左旋紫草素在体抗肿瘤作用可能是其抑制蛋白酶体功能的结果。
【学位授予单位】:广州医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R285

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