大鼠脂肪源性干细胞分离培养及与成纤纤细胞间接共培养的实实实究

【摘要】：【研究背景】 随着人口的老龄化,女性盆底功能障碍性疾病(Pelvic floor dysfunctional diseases PFD)的发病率逐年升高,是中老年妇女的常见疾病。女性盆底是由肌肉群、筋膜、韧带及其神经构成的支持系统。其互相作用和支持,承托并保持子宫、膀胱和直肠等盆腔脏器于正常位置。胶原蛋白则是韧带和筋膜这些支持结构的主要成分,对维持盆底支持组织的弹性和韧性起重要作用。研究表明,人体中有21种胶原蛋白分子。盆底筋膜及韧带主要是由I型胶原蛋白组成。I型胶原直径较粗,有很高的抗张强度,起支持作用。随着年龄的增长及其它相关病因的发生,人体内筋膜和韧带中成纤维细胞的增殖及表达I型胶原蛋白的能力逐渐降低,相关胶原含量的减少导致了韧带、筋膜等解剖结构张力降低,导致支持结构的松弛,最终导致盆底功能障碍性疾病(PFD)的发生【1】。 应用补片对盆底缺陷进行修复是目前治疗盆底功能障碍性疾病(PFD)的重要方法,常用的补片包括人工合成材料和生物补片材料,国内、国外文献报道人工合成补片具有侵蚀(erosion)并发症,发生率约13%-26%不等【2】【3】,而生物补片虽然具有生物相容性好、侵蚀率低等优点,但植入人体后的降解问题一直是临床上争论的焦点,其6个月后的降解率高达40%【4】。因此,寻找新的替代材料,是减少盆底重建手术并发症和降低术后复发的关键。 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。干细胞的主要特征是能无限分裂增殖。2001年,Zuk【5】等首次从人脂肪组织中分离获得一群具有多向分化潜能的细胞——即脂肪源性干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)。脂肪源性干细胞的主要优点是:1、来源丰富,取材方便,对人体无创伤;2、干细胞丰度高,少量的脂肪组织即可获得足够脂肪源性干细胞(ADSCs);3、较易培养,相较于其它种类的干细胞,脂肪源性干细胞(ADSCs)的培养要求相对较低;4、分裂增殖能力旺盛,脂肪源性干细胞(ADSCs)是目前生长最快的干细胞。因此脂肪源性干细胞(ADSCs)具有很好的临床运用前景。 【研究目的】 1、探讨ADSCs的分离培养的实验方法,为干细胞实验方法学提供依据。 2、运用ADSCs与大鼠筋膜成纤维细胞间接共培养的方法,探讨其对ADSCs表达I型胶原蛋白的影响。从而寻找能够替代衰老或损伤的盆底成纤维细胞并有效表达胶原蛋白的种子细胞,为盆底功能障碍性疾病提供新的治疗途径。 【研究方法】 1、用成年SD大鼠,雌雄不限,体重约为220-250g,取大鼠腹股沟侧的脂肪组织,消化分离后进行传代培养。取原代细胞分别以1×104/ml;1×106/ml;1×108/ml的细胞浓度接种,在1-7天后用MTT法检测。用MTT法对1-13代细胞进行生长曲线的测定,并对第4代细胞行HE染色及细胞形态学观察。 2、取第4代细胞进行表面标记物CD105、CD106、CD44、CD49d检测,进行ADSCs鉴定。 3、取经鉴定的ADSCs和自体来源的大鼠筋膜成纤维细胞间接共培养,在不同时间段取ADSCs用免疫细胞化学方法检测其I型胶原蛋白的表达。 【结果】 1、形成大量漩涡状或长梭状细胞集落,细胞表面标记物CD44, CD106,CD105,CD49d阳性率分别为99.59%,0.85%,95.00%,89.56%。 2、MTT绘制生长曲线显示大鼠脂肪源性干细胞经多次传代后细胞仍能保持较强的分裂增殖能力。体外培养第1、3、5、7代脂肪源性干细胞在1-2天处于潜伏期及缓慢增长期,第3天进入对数生长期,第4天后进入平台期,细胞生长曲线呈“S”形。第9-13代脂肪源性干细胞在第1-4天都处于潜伏期及缓慢增长期,第5-6天才进入对数生长期,第7天达到平台期,细胞生长曲线呈“S”形。 3、以1×104/ml原代细胞密度接种时,其生长曲线显示:在体外培养1-3天处于潜伏期、第3-4天进入缓慢增长期,第4-6天为对数生长期,第7天后进入平台期。以1×106/ml原代细胞密度接种时,其生长曲线显示在体外培养1-2天处于潜伏期、第2-3天为缓慢增长期,第3-5天进入对数生长期,第6天后进入平台期。以1×108/ml原代细胞密度接种时,其生长曲线显示在体外培养1-2天处于潜伏期、第2-3天为缓慢增长期,第3-4天进入对数生长期,第5天后进入平台期。细胞生长曲线呈“S”形。 4、HE染色观察细胞形态显示:第4代脂肪源性干细胞行HE染色后可见圆形细胞核呈紫色,核内见粗颗粒状染色质,胞浆呈淡红色。细胞呈长梭状或多角状。 5、与筋膜来源的成纤维细胞间接共培养3天、5天、7天的实验组较对照组I型胶原蛋白含量显著增加有统计学意义(P0.05)。实验组中共培养5天、7天与3天比较I型胶原蛋白含量增加有统计学意义(P0.05),实验组中共培养7天与5天比较I型胶原蛋白含量增加无统计学意义(P0.05)。 【结论】 1、本实验成功分离培养的大鼠脂肪源性干细胞,其表面标志物CD44,CD105,CD49d表达阳性,CD106表达阴性,但仍需进一步进行干细胞诱导实验加以证实。 2、在一定范围内,不同的干细胞接种密度会影响脂肪源性干细胞的分裂增殖。本实验证实以1×106/ml的ADSCs密度接种,细胞能较早进入对数生长期,且对数生长期持续时间最长。该细胞株持续至第13代仍然能够保持旺盛的分裂增殖能力及形态特性。 3、ADSCs与筋膜成纤维细胞间接共培养后,ADSCs表达I型胶原蛋白的含量增加。说明ADSCs与筋膜成纤维细胞间接共培养能促进ADSCs合成I型胶原蛋白,提示ADSCs可能运用于替代损伤或老化的盆底筋膜组织,但仍需进行体内试验证实。

【关键词】：盆底功能障碍性疾病 脂肪源性干细胞 筋膜成纤维细胞 间接共培养 I型胶原蛋白
【学位授予单位】：广州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329
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