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《广州医学院》 2010年
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人脐带血间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的实验研究

何志裕  
【摘要】:目的: 1.研究脐带血来源的间充质干细胞体外分离、纯化及培养的条件,以建立稳定的体外培养体系,满足实验和临床的需要。 2.探讨脐血间充质干细胞移植到心肌梗死大鼠体内,观察其是否可以存活及对大鼠心功能的影响。 方法: 1.无菌条件下采取健康育龄产妇正常分娩胎儿的脐带血42份,所有样本均于采集8h内分离。 2.脐带血42份随机分成3组: FBS(胎牛血清)未包被组,FBS包被组,Mesencult培养基组,每组12份。FBS未包被组和FBS包被组均使用含10%FBS的LG-DMEM培养基,Mesencult培养基组使用培养干细胞专用的Mesencult培养基,与其添加物配合使用。3组均用Ficoll淋巴细胞分离液,密度梯度法分离脐血单个核细胞(MNC),将单个核细胞按密度1 X 108/ml接种于T25培养瓶中 3.培养瓶置37℃饱和湿度含5%CO2孵育箱培养,72h后全量换液,去除未贴壁细胞,以后均7天换液一次。待细胞长到80%铺满瓶底时结束原代培养,按1:1进行消化传代。观察不同培养条件对脐血MSCs生长的影响。 4.流式细胞术分析P2代细胞表面CD29、CD34、CD45、CD105标志。 5.将36只SD大鼠随机分成MSCs移植组、假手术组和心肌梗死组各12只。结扎左冠状动脉前降支制备大鼠心肌梗死模型, 1周后,经尾静脉注射带DAPI标记的脐血MSCs。 6.4周后测定大鼠血流动力学,并行免疫组织化学检测移植细胞存活与分化情况及检测梗死组织中FactorⅧ表达来比较三组微血管密度。 结果: 1.实验观察显示:经典的MSCs培养方法,用未经胎牛血清包被培养瓶培养的MNC很少出现贴壁,且大多为形态多样的混杂细胞,无明显的细胞集落形成。在少数标本中约2周后细胞可达到融合,主要表现为大的扁圆形细胞、破骨细胞和梭形成纤维样的MSCs,尽管这些混杂细胞原代培养也可以达到融合,但其扩增能力明显受到限制,且传代未达2代。而脐血单个核细胞在合适的培养基中,以较高的密度种植于经胎牛血清包被的培养瓶内,原代培养产生的贴壁细胞以间充质干细胞为优势细胞,混杂有少量破骨样细胞。而在Mesencult培养基下培养,经传代后这些贴壁细胞可以被纯化为生长良好的间充质干细胞。其能保持良好的扩增能力和均质性。42份脐血中单个核细胞原代培养,其中仅8份传代培养成功,而其中Mesencult条件培养基有5份培养成功,明显高于经典培养方法。原代和P2代脐血MSCs的生长特性进行观察比较,原代MSCs在接种后的2-8d为生长的潜伏期,10-14d以后细胞进入对数生长期,3-4周左右逐渐进入平台期,P2代脐血MSCs扩增速度明显快于原代培养,2-4d倍增1次,5-10d后细胞进入到对数生长期,10-14d进入平台期。 2.通过流式细胞仪检测P2代的脐血MSCs结果显示,P2代MSCs极弱表达CD34、CD45造血细胞标志,稳定地高表达CD29、CD105间充质细胞相关的表面抗原。这与骨髓MSCs的表面抗原标志相一致。表明脐血MSCs是存在于脐血中区别于造血细胞的一群处于未分化状态的非定向干/祖细胞。 3.移植后4周,经血流动力学检测,与心梗组比较,MSCs移植组左室心功能明显改善(P0.05),移植组心肌组织中可以观察到DAPI标记细胞存在,但标记细胞并未表达Troponin-T及connexin43,免疫组化染色检测示MSCs移植组心肌微血管密度(MVD)明显高于心梗组和假手术组。 结论 1.脐血单个核细胞以高密度(1X108cells/ml )接种在Mesencult培养基中、FBS包被培养瓶等条件下,可以在体外成功的培养出较纯化的脐血MSCs,其培养成功率较高。脐血MSCs的免疫表型符合间充质干细胞特征。 2.经尾静脉移植的脐血MSCs能存活在心肌梗死大鼠心肌组织中。 3.脐血MSCs移植能促进心梗大鼠心功能恢复,并刺激梗死部位血管生成。
【学位授予单位】:广州医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R329

【参考文献】
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