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《广州医学院》 2011年
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铜绿假单胞菌相关性肺损伤蛋白质差异表达研究

刘冬冬  
【摘要】:背景 急性肺损伤(ALI)是指心源性以外的各种肺内、外致病因素导致的急性、进行性呼吸衰竭。其严重阶段即急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。根据流行病学调查显示,在过去的十年,伴随氧疗、机械通气、液体管理等治疗技术的进步,其病死率并没有显著下降,依然在40%-60%。有研究认为,居高不下的病死率跟ALI/ARDS的诊断标准有很大关系,因为目前临床沿用的诊断标准是一个非特异性的标准,而且,缺乏与高危因素相关的前瞻性研究。这就意味着依靠目前的诊断我们无法区分ALI/ARDS到底是重症肺炎、脓毒症这种因细菌感染而继发的,还是机械通气这种物理因素引起的,抑或是创伤后化学因素导致的(根据对重症监护病房的ALI/ARDS病因调查研究显示,重症肺炎和脓毒症的比例分别为50%和26%左右,创伤和机械通气排其后)。而这些高危因素恰恰是ALI/ARDS发生和发展最重要的因素,能否获得早期确诊和治疗是降低病死率的关键。 蛋白质是基因功能的直接执行者,是后基因时代最为主要的生物学研究对象,与之相关的技术称为蛋白质组学,其中以双向凝胶电泳(2-DE)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的联用成为当下研究的首选。以病变组织或细胞为样本进行蛋白质组学的研究,能真实反映机体的疾病状态,为疾病的早期诊断提供新的特异性分子标志物,同时又可以跟踪疾病的进展和预后情况,为探讨疾病的发病机制提供新的线索,因此被认为具有临床应用的重要价值和前景。在过去的二十年,运用这项技术已经在肺癌、乳腺癌、口腔癌、肝癌等多种肿瘤疾病中筛选出高特异性的生物标记物,并成功运用于临床的早期监测。虽然蛋白质组学运用在肺部非肿瘤领域的研究才刚刚起步,但是目前的研究成果(在COPD、ALI、哮喘组筛选出区别正常组的蛋白质)表明,这项技术会对ALI高危因素早期诊断的重要生物学证据的寻找提供极大的帮助。 目的 筛选铜绿假单胞菌肺损伤的差异表达蛋白质,为潜在的诊断标志物和有效的治疗靶点提供线索。 方法 1、样本收集处理:60只雄性SPF级SD大鼠随机分为铜绿假单胞菌组、油酸组、机械通气组和空白组。各组分别于设定时间点取肺组织固定行常规病理学观察和评分、制成匀浆行细菌菌落计数以及计算湿干比重(W/D),取肺泡灌洗液行ELISA检测细胞因子TNF-α、IL-1β水平。 2、蛋白分离鉴定:双向电泳(2-DE)对各组总蛋白进行分离,考马斯亮蓝染色凝胶后扫描分析差异的蛋白质点。酶切差异的蛋白质点并进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析获得肽质量指纹图谱(PMF),最后通过NCBInr蛋白质数据库鉴定是蛋白质种类。 3、差异蛋白质的验证:选取可能与铜绿假单胞菌感染相关的差异蛋白质,运用荧光定量PCR(QPCR)、免疫印迹(Western blot)和免疫组化(Immunohistochemistry)方法对其进行验证。 结果 1、铜绿假单胞菌组、油酸组、通气组的肺损伤评分都明显升高;与空白组比较,三组在W/D、TNF-α、IL-1β水平都有显著升高。 2、铜绿假单胞菌组、油酸组、通气组和空白组凝胶间平均匹配点数878±16、841±23、725±39、1176±19 ,平均匹配度分别为86.6%、87.2%、82.9%、89.3% ,建立了重复性较好的双向凝胶电泳图谱。选择22个差异表达的蛋白质点(11个在铜绿假单胞菌组表达上调,4个在通气组表达上调,3个在油酸组表达上调)进行MALDI-TOF-MS鉴定,分析出18种蛋白质。通过文献检索发现2种蛋白质可能与铜绿假单胞菌感染引起的ALI相关,分别为过氧化物氧化还原酶1(Peroxiredoxin1)、钙网蛋白(Calreticulin)。 3、QPCR在mRNA水平、Western blot和Immunohistochemistry在蛋白水平验证Peroxiredoxin1和Calreticulin在铜绿组表达上调,与双向电泳结果一致。 结论 成功建立铜绿假单胞菌、油酸和机械通气三种因素导致的急性肺损伤大鼠模型,并运用2-DE/MALDI-TOF-MS筛选、鉴定出三组间的差异表达蛋白,其中Peroxiredoxin1和Calreticulin可能通过对氧化/抗氧化和免疫应答的调节在铜绿假单胞菌感染相关性急性肺损伤中起着重要作用。本研究为进一步探讨铜绿假单胞菌感染相关性急性肺损伤的发病机制提供新的线索。
【学位授予单位】:广州医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R563.8

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