RNA干扰在体外、体内抑制TNF-α表达的实验研究

【摘要】： 第一部分化学合成的siRNA对活化的小鼠巨噬细胞肿瘤坏死因子α表达的影响 目的观察靶向小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因的化学合成的小干扰RNA(siRNA)在体外对小鼠巨噬细胞系RAW264.7表达TNF-α的抑制作用。方法采用化学法合成针对TNF-αmRNA不同位点设计的3条siRNA序列(siRNA1-3)和1条带有荧光标记的BLOCK-ITTM Fluorescent荧光Oligo(修饰的荧光标记的dsRNA)通过脂质体包裹后将其分别转染至小鼠巨噬细胞系RAW264.7,同时设立一个无任何靶基因的siRNA做为阴性对照(siRNA4)。荧光显微镜下观察siRNA的转染效率;用实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附实验(ELISA)法分别检测siRNA对TNF-α的mRNA和蛋白表达的抑制作用。结果内毒素刺激后6 h ,巨噬细胞表达TNF-αmRNA和合成分泌的TNF-α量均增加,于9～12 h达高峰。利用荧光标记的Oligo观察到siRNA转染效率达72%～80%。siRNA1-4转染巨噬细胞后, siRNA2、3可见内毒素刺激的TNF-αmRNA(0.158±0.030、0.114±0.028)和TNF-α蛋白表达[(1355±348)pg/ml、(817±138)pg/ml]均明显少于未转染组[TNF-αmRNA 0.294±0.147,蛋白(2104±32)pg/ml,均P 0.05],其中siRNA3的抑制率非常显著,达61.2%(P 0.01)。siRNA1、阴性对照siRNA4对细胞基因及蛋白表达无影响。结论内毒素可刺激小鼠巨噬细胞TNF-α的合成。化学合成的siRNA转染小鼠巨噬细胞能有效抑制TNF-αmRNA及蛋白的表达。 第二部分发夹样siRNA抑制小鼠巨噬细胞TNF-α表达 目的:研究特异性载体介导的小干扰RNA(siRNA)对小鼠巨噬细胞株RAW264.7表达肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因的抑制作用。方法:设计两段靶向TNF-α基因的特异性siRNA,合成相应寡核苷酸,插入载体H1启动子下游,构建表达干扰性发夹状RNA(Short hairpin RNA, shRNA)的载体pHS-A和pHS-B,转染小鼠巨噬细胞株,用实时荧光定量PCR和ELISA法检测siRNA对TNF-α的mRNA和蛋白表达的抑制作用。 结果: pHS-A转染后,LPS刺激巨噬细胞的TNF-αmRNA为0.00356±0.00187, TNF-α蛋白表达为149.93±21.02 pg/ml,比未转染组(TNF-αmRNA 0.02134±0.00960,蛋白1922.30±149.05pg/ml)显著减少P 0.01),抑制率达83.3%。pHS-B及阴性对照组对基因及蛋白表达均无影响。结论: pHS-A可成功地表达了发夹状,并且能抑制小鼠巨噬细胞TNF-α表达。 第三部分应用载体构建shRNA对小鼠葡聚糖硫酸钠结肠炎的影响 目的:探讨载体构建shRNA对小鼠葡聚糖硫酸钠( DSS)结肠炎的治疗作用,寻找治疗溃疡性结肠炎(UC)的新途径。方法: 30只BALB /C小鼠随机分为: (1)生理盐水对照组(2)4% DSS口服+生理盐水模型组(3)4% DSS口服+载体构建shRNA治疗组,每组10只。各组小鼠每天记录和计算其结肠炎活动指数(DAI)评分;取小鼠结肠粘膜组织进行大体及组织形态学观察、用酶联免疫吸附法( ELISA)测定肿瘤坏死因子–α(TNF–α)水平、荧光定量PCR检测TNF-αmRNA表达。结果:模型组和治疗组小鼠的DAI评分、组织学评分和肠粘膜组织内TNF-α基因和蛋白表达均明显高于正常对照组(均P 0. O5);而治疗组的上述指标均又明显低于模型组,治疗组与对照组的结肠组织学评分和TNF-αTNF-α基因和蛋白的表达分别为5.30±0.48和8.50±0.53(P 0.05),0.31±0.11和0.42±0.04(P 0.05),(28.13±3.23)pg/g和(39.43±3.90)pg/g(P 0.05)。结论:载体构建的shRNA对小鼠DSS结肠炎有保护作用。