针刺大鼠外关穴对不同脑区CREB磷酸化及相关信号转导机制研究

【摘要】：1研究目的： 经穴特异性的中枢作用机制是现代针灸理论研究的重要方面,然而现有的针刺调控机制主要着眼于针刺效应与靶器官之间的相关性研究,并且将针刺作用直接与效应器相联系,从而忽视了脑功能在整体调控中的作用。“经穴特异性与脑相关”假说认为人体作为生物体,针刺经穴干预的反应和调节作用必须经过脑作为中枢(即信息的传导和转导的枢纽)的调整和整合,再作用于靶器官,从而呈现治疗效应。因此,探讨针刺效应中的脑功能变化特点及其相关生物学机制有助于揭示针刺作用规律。本研究拟从针刺效应的脑功能影像学文献研究入手,通过对近10年来国内脑功能影响研究资料的系统评价,总结目前较为公认的针刺穴位的效应脑区,之后通过观察针刺对大鼠不同脑区CREB (CAMP response element binding protein CAMP应答元件结合蛋白)磷酸化表达分析及相关信号转导通路的基因芯片筛查,探讨针刺穴位的效应脑区及其效应物质,为“经穴特异性与脑相关”学说的进一步研究奠定基础。 2研究方法： 首先通过基于功能性磁共振的穴脑相关文献的系统评价,追溯近10年来针刺穴位对不同脑区激活情况的功能性磁共振研究,对CNKI期刊全文数据库及重庆维普中文期刊全文数据库中检索到的223篇相关文献进行分析筛选。根据研究的纳入标准和排除标准,最后共获得符合要求的观察针刺健康人穴位的功能性磁共振临床研究的文献8篇。经Mate分析研究后认为小脑及皮质相关脑区有可能是穴位效应的相关脑区。 2.1在针刺大鼠外关穴对不同脑区CREB及磷酸化CREB表达影响的研究中,选用健康清洁级SD大鼠30只,随机分为空白组、外关即刻组、外关20分钟组、非穴即刻、非穴20分钟组,每组6只大鼠,针刺外关穴及外关非穴各20分钟。空白组大鼠除了模拟针刺大鼠时相同的抓取动作外,不做任何处理；外关即刻组大鼠留针20分钟后立即取脑；外关20分钟组,留针20分钟后,起针,置于鼠笼中20分钟后断头取脑；非穴即刻组大鼠,针刺大鼠外关非穴并留针20分钟后立即取脑；非穴20分钟组大鼠,针刺外关非穴并留针20分钟后,起针,置于鼠笼中20分钟后断头取脑。各组大鼠完成干预后,即刻取样,按常规免疫组化步骤操作,分析各组切片的CREB及p-CREB的阳性表达。 2.2针刺大鼠外关穴对小脑信号转导通路的基因表达研究的干预操作同前,各组大鼠在处理后,在不同时间点(即刻、20分钟)迅速断头取脑,取新鲜脑组织,迅速取出小脑扁桃体部分。采用美国Super Array公司的信号转导通路发现者基因芯片(Oligo Signal Transduction PathwayFinderTM Microarray),进行基因芯片分析,通过提纯RNA,RNA质量检测,cRNA标记与合成,芯片杂交等步骤,获得在X线曝光下的照片,并保存为灰度(8或16 bit)的电子文档,并使用网上提供的综合型GEArray表达分析配套软件(GEArray Expression Analysis Suite)进行完整的芯片数据分析。 3研究结果： 3.1在针刺大鼠外关穴对不同脑区CREB及磷酸化CREB表达影响的研究结果表明,针刺外关及外关非穴相比空白组而言,在小脑及皮质扣带回的CREB表达是具有显著的统计学差异的,且都表现为引起了CREB表达的增加,但基于穴位效应的针刺穴位与非穴对CREB表达的作用在各组间比较中均未显示出具有统计学意义的差异。 而p-CREB在针刺穴位后表现出了较强的特异性,不论在小脑抑或皮质扣带回,针刺外关组的p-CREB的表达均明显增强,且针刺外关组较针刺非穴组有统计学上的显著性差异。但在针刺20分钟后p-CREB的表达并未出现如即刻效应时的显著性差异,针刺外关组小脑扁桃体区的p-CREB与非穴组相比无显著性差异,而皮质扣带回区的磷酸化CREB仍较非穴组相比表达增强,且具有显著性差异。 不同脑区p-CREB在不同时间点表达变化的轮廓分析结果表明,从就时间与脑区的交互作用分析,F=2.325,P=0.246,可认为两个脑区的总体轮廓相互平行,即小脑与皮质扣带回在三个不同时间的反应基本一致,且重合轮廓检验结果表明F=143.869,P0.0001,即表明这两个轮廓并不重合,且皮质扣带回的表达强度明显高于小脑。 3.2针刺大鼠外关穴对小脑信号转导通路的基因表达研究结果表明,就各因素基因表达的两两比较而言,即刻状态下外关穴针刺有效激活了多个通路的表达,使得多个基因表达上调。同时在外关的即刻效应中,7号基因的表现较为引人瞩目,针刺外关即刻时不论是20分钟后还是与空白组比较,其表达都明显增强,作为抗凋亡基因Birclb是Naip2 NLR家族的成员,其表达的是凋亡抑制蛋白-2,所属的信号转导通路是survival通路,提示其存在与针刺效应的相关性。 在对各基因所属相关信号转导通路的聚类分析中发现,Wnt信号转导通路及NFκB信号转导通路、Survival信号转导通路在即刻状态的穴位刺激中差异表达显著,都有至少4种相关信号通路的基因表达作为支持。综合之前的各基因两两比较分析可以发现,无论是Wnt通路、还是Survival通路,以及NFκB信号转导通路,在针刺外关穴即刻后比非穴即刻组或空白组都出现了基因表达的上调,这表明这三组信号转导通路很可能与针刺穴位的效应有联系。 4结论： 4.1由于技术路线、研究手段甚至数据采集的模式均存在较大差异,目前开展针刺效应脑功能影像学研究系统评价的意义可能不大。但根据Meta的结果,小脑及皮质脑区仍然是穴位-脑功能效应研究中颇为受人关注的焦点。 4.2针刺外关及外关非穴都能造成CREB在小脑及皮质的表达增加,但p-CREB的表达在外关穴与非穴的的即刻效应中具有显著性差异。因此本研究认为如果说刺激方式本身能造成响应脑区的特异性激活的话,那么体现穴位特异性效应的生物过程则是相关蛋白的磷酸化现象。 4.3CREB的磷酸化途径受多种信号转导通路的调控,同时p-CREB也调节着下游各级细胞因子的基因表达及转录调控,因此效应脑区内CREB磷酸化的上游途径及下游靶基因则是下一步研究的核心。通过对基因芯片原始数据的聚类分析、因子分析及主成分分析表明,survival通路及wnt通路在针刺外关穴与非穴对大鼠小脑的激活中存在特异性的表达。然而查阅文献表明,不论survival通路还是wnt通路主要还是参与了对神经元细胞的发育及凋亡的调控,尽管有研究表明针刺穴位有助于脑损伤后这两条通路的表达,从而发挥神经元的保护作用,但本研究是基于正常生理状态大鼠的研究,因此它们在针刺穴位的靶效应脑区是如何发挥作用的,仍然需要进一步的研究。

【关键词】：针刺 外关 CREB 信号转导
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R245
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