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《广州中医药大学》 2011年 博士论文
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疏肝清毒汤诱导人肝癌细胞HepG-2凋亡及其机制的实验研究

李姵萱  
【摘要】:1.目的:疏肝清毒汤是对癌症具有比较客观疗效的—自拟方,本文以其来处理肝癌细胞株HepG-2,以初步探讨疏肝清毒汤体外抗肝癌的作用机制。 2.方法: 2.1细胞的培养:用0.06%胰蛋白酶将HepG-2细胞分散成单个细胞悬液,用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成浓度为3×105个/ml的细胞悬液,按0.1ml/孔分种于96孔板,置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养。 2.2疏肝清毒汤对HepG-2细胞的毒性作用实验:将疏肝清毒汤原液作系列倍比稀释成以下八个浓度100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78g/L。用0.06%胰蛋白酶将HepG-2细胞分散成单个细胞悬液,用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成浓度为3×105个/ml的细胞悬液,按0.1ml/孔分种于96孔板,置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养,培养24小时细胞贴壁,2d后换含药培养液0.1ml/孔,每个浓度2孔,并设不加药物的对照。置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内继续培养,12d后去掉上清,将所余细胞用MTT法测药物细胞毒性。 2.3疏肝清毒汤对HepG-2细胞生长曲线的影响:取对数生长期细胞用10%胎牛血清的DMEM培养液配成细胞数为1×104/ml的单细胞悬液,在24孔培养板中接种细胞,每孔1ml。培养24小时细胞贴壁后,用完全培养基将疏肝清毒汤稀释至浓度为60g/L和30g/L,对照组用2%DMEM取代疏肝清毒汤。37℃、5%CO2、饱和湿度条件下于CO2培养箱中培养。在培养后即刻及1、2、3、4、5、6、7天,各取样4孔,消化后各孔取40μl,加0.4%台盼蓝染液10μl,置血球计数板计数拒染的活细胞数,并与培养时间作图。 2.4疏肝清毒汤对HepG-2细胞AFP分泌的影响:将疏肝清毒汤原液作系列倍比稀释成以下八个浓度60、30、15、7.5、3.751、1.875、0.938、0.469g/L。用0.06%胰蛋白酶将HepG-2细胞分散成单个细胞悬液,用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成浓度为3×105个/ml的细胞悬液,按0.1ml/孔分种于96孔板,置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养,培养24小时细胞贴壁,2d后换含药培养液0.1ml/孔,每个浓度2孔,并设不加药物的对照。置37℃、饱和湿度、5%C02培养箱内继续培养;12d后收集上清,用人血清甲胎蛋白(AFP)酶联定量诊断试剂盒检测上清中AFP的分泌量。 2.5疏肝清毒汤对HepG-2细胞ALT和LDH的影响:用0.06%胰蛋白酶将HepG-2细胞分散成单个细胞悬液,用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成浓度为3×105个/ml的细胞悬液,将细胞悬浮液加入96孔培养板中,每孔200μl,置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养,培养24小时细胞贴壁。弃培养液,加入浓度为60g/L和30g/L的疏肝清毒汤,每个浓度2孔,对照组用2%DMEM取代疏肝清毒汤。分别培养24 h和48 h后离心收集上清,用酶联免疫法(ELISA)检测ALT、LDH。 2.6疏肝清毒汤对HepG-2肝癌细胞凋亡的影响:取对数生长期的细胞,0.06%胰酶消化后制成单细胞悬液,0.4%台盼蓝染色,计算拒染的活细胞率为97.5%。将细胞悬液接种至50cm2培养瓶中,106个细胞/瓶,培养液为含10%FCS、100U/ml青链霉素的10%胎牛血清的DMEM,在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24小时后,更换培养液,药物组:每瓶培养液5 ml中加入疏肝清毒汤终浓度为60g/L、30g/L;对照组加入等量2%DMEM。加药后于24小时、48小时每个时间点各取3瓶细胞,进行检测。凋亡细胞的检测:小心弃掉培养液,0.06%胰酶消化3分钟,轻轻吹打细胞成单细胞悬液,1000r/min离心10分钟,Binding Buffer重悬细胞至1×106/ml,取100μl细胞悬液(HepG-2细胞)至5ml FACS管中,加入5μl Annexin V-FITC,10μlF混匀,室温下避光孵育15分钟后每管加入400μl Binding Buffer,1小时内上机进行流式细胞分析。同时设对照管(主细胞)和补偿设置管,即未染色的细胞,单染Annexin V-FIT的管和单染PI的管。FCM流式细胞术分析:采用FACS Calibur(美国BECKMAN COULTE公司)ALTRA型流式细胞仪,488nm激发光源。先将对照管上样,通过调整参数FSC和SSC,在散射光点图(FSC/SSC)中清获显示出一个清晰、集中的细胞群体,对细胞群体进行设门(Gate),再以门中细胞进行后续荧光信号检测。将对照管(裸细胞)的荧光强度设定为非特异性本底荧光,并在此基础上确定阳性荧光表达比率。调定流式细胞仪,使荧光散入图中裸细胞集中分布在左下象限。保持FL1、FL2、FL3不变分别将单染AV-FITC的管和单染PI的管上样,调整仪器荧光补偿值,进行光谱重叠校正后即可分析样本。每个样本上获取10,000个细胞,采用CellQuest功能软件进行分析。 2.7AO/EB荧光染色法测定疏肝清毒汤诱导HepG-2细胞凋亡:将1×106/ml HepG-2细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,加入疏肝清毒汤终浓度为60g/L、30g/L,置37℃、5%CO2浓度及饱和湿度的恒温培养箱中悬浮培养,孵育后分别于24及48小时观察结果。AO/EB染色及观察结果:取细胞悬液100μl,加入AO/EB染料4μl混匀,置1滴于载玻片,上覆盖玻片,荧光显微镜下观察结果并计数200个细胞。 2.8疏肝清毒汤对细胞凋亡调控基因p53的影响:细胞爬片分组以24孔培养板每孔置入一块无菌玻片,取对数生长期HepG-2细胞消化制备成细胞悬液,调整细胞浓度为1×105/ml,接种24孔板内lml/孔。置培养箱24小时后,中药组加入疏肝清毒汤终浓度分别为60g/L和30g/L,对照组加入2%DMEM,以上各组均平行三孔,继续培养48小时后,取出爬满的细胞的玻片,用PBS漂洗二遍,经4%多聚甲醛固定30分钟,PBS洗涤后自然风干,-20℃保存备用。检测方法按试剂盒说明书进行,主要步骤有:滴入过氧化物酶阻断剂50μl;37℃10分钟;PBS反复洗三次,滴入正常非免疫羊血清50μl;37℃10分钟,直接甩干,分别加入p53一抗,37℃2小时;PBS洗3次,滴入生物标记的二抗,37℃10分钟;PBS洗3次,滴入链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶溶液,37℃10分钟;PBS洗3次,滴入新鲜配制的DAB显色溶液,光学显微镜下观察显色效果,至显色明显,用自来水冲洗后,苏木素复染。中性树胶封固,摄像。 2.9疏肝清毒汤对HepG-2肝癌细胞的Fas/FasL表达的影响:细胞的准备:取对数生长期细胞用10%胎牛血清的DMEM培养液配成细胞数为1×104/ml的单细胞悬液,在24孔培养板中接种细胞,每孔1ml。培养24小时细胞贴壁后,用完全培养基将疏肝清毒汤稀释至浓度为60g/L和30g/L,对照组用2%DMEM取代疏肝清毒汤。37℃,5%CO2、饱和湿度条件下于CO2培养箱中培养。 Fas/FasL mRNA相对表达量的变化:分别抽提对照组HepG-2,疏肝清毒汤60g/L、30g/L组HepG-2三组细胞总RNA,逆转录为cDNA。取逆转录反应产物1μl作为模板,共扩增Fas基因片段和内参β-actin。PCR反应条件:94℃预变性5min,94℃变性45s,64℃退火30 s,72℃延伸1min,经35个循环。扩增产物在1.8%琼脂糖凝胶中电泳,将结果在凝胶呈像系统中扫描其辉度值,以Fas基因与内参基因的辉度比值作为其相对表达量,比较各组之间的差别。同样实验共重复3次。取逆转录反应产物1μl作为模板,共扩增FasL基因片段和内参β-actin。PCR反应条件:94℃预变性5 min,94℃变性45 s,58℃退火30 s,72℃延伸1 min,经38个循环。扩增产物在1.8%琼脂糖凝胶中电泳,将结果在凝胶呈像系统中扫描辉度值,以Fas L基因与内参基因的辉度比值作为其相对表达量,比较三组之间的差别。同样实验共重复3次。 3.结果 3.1疏肝清毒汤对HepG-2细胞的毒性作用实验:(1)疏肝清毒汤在设定的八个浓度(100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78g/L)时,对HepG-2细胞的药物半数毒性浓度TC50为62.65 g/L,对HepG-2细胞的破坏率分别为107.66、37.83、5.82、-0.97、-3.88、-15.52、4.85、21.34%;(2)疏肝清毒汤在浓度100g/L,细胞出现空泡、萎缩、脱落,破坏率分别达107.66%和88.90%;疏肝清毒汤浓度为50g/L,镜下可见细胞形态大致正常。 3.2疏肝清毒汤对HepG-2细胞生长曲线的影响:疏肝清毒汤浓度为60g/L,在0-7天时,其细胞数分别为1、1.7、1.8、1.2、0.9、0.7、0.4、0.3万/ml,浓度为30g/L,其细胞数分别为1、1.7、1.9、1.6、1.4、0.9、0.6、0.4万/ml,细胞增殖缓慢。可见,疏肝清毒汤(60g/L、30g/L)能抑制’HepG-2细胞的生长。 3.3疏肝清毒汤对HepG-2细胞AFP分泌的影响:疏肝清毒汤浓度为60g/L和30g/L时,HepG-2细胞AFP的分泌量为13.22 ng/ml和18.08 ng/ml,而对照组为214.52 ng/ml。根据正常参考值为小于20ng/ml的标准,可以看出当疏肝清毒汤浓度在60、30 g/L时,能抑制HepG-2细胞AFP的分泌,在体外对肝癌细胞HepG-2的AFP分泌有抑制作用。故疏肝清毒汤在体外抑制肝癌细胞HepG-2分泌AFP的作用较好。 3.4疏肝清毒汤对HepG-2细胞ALT和LDH的影响:加入疏肝清毒汤24h后,疏肝清毒汤60g/L组ALT为12.34 U/L,LDH为182.42 U/L,疏肝清毒汤30g/L组ALT为10.89 U/L,LDH为165.33 U/L,与空白组比较有极显著性差异;加入疏肝清毒汤48 h后,疏肝清毒汤60g/L组ALT为18.60 U/L,LDH为284.40 U/L,疏肝清毒汤30g/L组ALT为15.18 U/L,LDH为218.30 U/L,与空白组比较有显著性差异。 3.5疏肝清毒汤对HepG-2肝癌细胞凋亡的影响:疏肝清毒汤随浓度增加,HepG-2细胞的凋亡率升高,出现典型的凋亡峰,与对照组相比差异有显著性(P0.05)。但本实验凋亡率较小,可能与细胞凋亡发生的整个过程短暂,凋亡时间不同步,部分凋亡细胞碎裂未能检测到有关。但实验结果还是较明确地证明了疏肝清毒汤能直接诱导HepG-2细胞凋亡,这可能是疏肝清毒汤抗肝癌的重要机制之一。 3.6AO/EB荧光染色法测定疏肝清毒汤诱导HepG-2细胞凋亡:对照组细胞在24和48小时其凋亡率分别为2.10%和3.21%;疏肝清毒汤60g/L诱导HepG-2细胞凋亡,在24和48小时其凋亡率分别为8.90%和18.32%;疏肝清毒汤30g/L诱导HepG-2细胞凋亡,在24和48小时其凋亡率分别为6.40%和12.54%。 3.7疏肝清毒汤对细胞凋亡调控基因p53的影响:疏肝清毒汤组p53表达显色较对照组明显加深,呈强染色,且阳性细胞数明显增多。疏肝清毒汤浓度为60g/L时,p53阳性细胞率为33.56%,疏肝清毒汤浓度为30g/L时,p53阳性细胞率为29.45%,与空白对照组比较,有显著性差异(P0.05),且呈剂量依赖关系。 3.8疏肝清毒汤对HepG-2肝癌细胞的Fas/FasL表达的影响:(1)Fas基因mRNA相对表达量的变化:Fas基因与β-actin RT-PCR共扩增,表明以疏肝清毒汤60g/L剂量处理后的HepG-2细胞其Fas基因的相对表达量较对照组明显增高。(2)FasL基因mRNA相对表达量的变化:FasL基因与β-actin RT-PCR共扩增,表明疏肝清毒汤60g/L剂量组HepG-2细胞Fas L基因的相对表达量较空白对照组和阴性对照组明显增高。 4.结论 4.1疏肝清毒汤能抑制HepG-2细胞的生长,对HepG-2细胞有明显的细胞毒作用,并且这种改变随着药物作用时间的延长而更加明显。 4.2疏肝清毒汤在体外抑制肝癌细胞HepG-2分泌AFP的作用较好。 4.3疏肝清毒汤抗癌的作用机制是诱导细胞凋亡,且诱导作用随诱导时间延长,其细胞凋亡率逐渐增高。 4.4疏肝清毒汤能上调人肝癌细胞HepG-2凋亡相关基因p53的表达,且呈剂量依赖关系。 4.5疏肝清毒汤能上调Fas/FasL的表达,从而诱导肝癌细胞的凋亡。


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