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《广州中医药大学》 2011年
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泄浊除痹方治疗高尿酸血症物质基础研究

刘志刚  
【摘要】:中药复方物质基础研究是中药现代化和国际化的前提和基础,是目前亟待解决的中药(复方)现代化关键问题之一。中药(复方)现代化的进程中,首先要揭示中药(复方)发挥作用的药效物质基础。中药复方物质基础是中药复方中发挥药理学治疗作用的化学成分的集合。目前中药复方物质基础研究方法包括中药化学与药效学结合的方法、血清药物化学和血清药理学结合的方法、细胞膜色谱法等。 本研究采用中药化学与药效学结合的方法对中药泄浊除痹方治疗高尿酸血症的物质基础进行了初步探讨:采用现代液相分析技术,对泄浊除痹方中活性成分进行了含量测定;采用色谱技术对泄浊除痹方含量较高的总黄酮部位进行了分离纯化研究,并系统研究了泄浊除痹方总黄酮部位体外对小鼠肾脏近曲小管上皮细胞(RTECs)增值、尿酸吸收及小鼠尿酸转运蛋白(RST)基因的负性调控,初步证实泄浊除痹方总黄酮为其治疗高尿酸血症的有效部位之一。 本研究主要包括以下研究内容: 1、泄浊除痹方中活性物质含量测定 本研究采用HPLC法测定泄浊除痹方中薯蓣皂苷元、蜕皮甾酮、落新妇苷的含量。Agilent HC-18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);以乙腈-甲醇(2:3)为流动相,流速为1mL-min"1,检测波长为206 nm,测定方中薯蓣皂苷元的含量,回收率为104.51%;AgilentTC-18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-水(17:83)为流动相,流速为1mL-min-1,检测波长为243 nm,测定方中蜕皮甾酮的含量,回收率为93.94%;KromasilC-18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-磷酸-水(20:0.025:80)为流动相,检测波长为290 nm,测定方中落新妇苷的含量,回收率为99.46%;以上含量测定方法经方法学验证,分析快速、准确、灵敏度高、重现性好。 2、泄浊除痹方总黄酮有效部位纯化分离研究 本研究以黄酮类成分为研究指标,完善补充了君药土茯苓的定性、定量方法,采用薄层色谱法进行了落新妇苷的鉴别,高效液相法(HPLC)建立了落新妇苷、黄杞苷的含量测定方法;采用高效液相法测定了提取溶液中落新妇苷含量,比色法测定了提取溶液中总黄酮含量,以正交试验进行了土茯苓总黄酮有效部位的提取工艺优化,考察了乙醇浓度、提取温度、固液比、提取次数等因素,确定提取工艺为以10倍量60%乙醇,沸水浴回流提取2次,经验证,总黄酮提取率可达95.99%。以土茯苓总黄酮、落新妇苷、黄杞苷含量为指标,通过考察静态、动态吸附试验,筛选了聚酰胺颗粒分离纯化土茯苓及泄浊除痹方总黄酮有效部位的科学合理的工艺条件,聚酰胺富集物中总黄酮含量为75.63%,转移率为68.24%,落新妇苷含量为12.77%,转移率为73.05%。 3、泄浊除痹方化学成分分离纯化及结构研究 本研究采用系统溶剂法、硅胶柱色谱法、聚酰胺柱色谱法等分离纯化技术分离泄浊除痹方化学成分;利用理化性质、红外吸收光谱、核磁共振碳谱与氢谱、质谱等鉴别化合物结构,并与相关文献对照,确认化合物。从泄浊除痹方中分离出7个化学成分,其中六个已鉴定结构,分别是p-谷甾醇(晶Ⅰ,β-Sitosterol)、齐墩果酸(晶Ⅱ,Oleanolic acid)、熊果酸(晶Ⅲ,Ursolic acid)、落新妇苷(晶Ⅳ, Astilbin)、黄杞苷(晶V, Engelitin)及p-蜕皮甾酮(晶Ⅵ,β-Ecdysterone)。 4、泄浊除痹方总黄酮降尿酸机理研究 进行了小鼠肾脏近曲小管上皮细胞原代培养条件优化及功能测试研究:经机械破碎的肾脏皮质组织在400U胶原酶Ⅰ处理20 min时,肾小管节段贴壁率达到最高,为54.5%;首次换液最佳时间为72 h;细胞在原代培养第4-7天生长达到对数期,在第10天状态开始下降。在1500μmol-L-1尿酸浓度的吸收培养基中,吸收实验进行30 min时,其对尿酸吸收速率达到最大。阳性药物丙磺舒和苯溴马隆在不同的浓度下,对尿酸吸收的抑制率不同,苯溴马隆的抑制率高于丙磺舒。 泄浊除痹方总黄酮对小鼠肾脏近曲小管上皮细胞增殖及尿酸吸收的影响:将原代培养的小鼠肾脏近曲小管上皮细胞用不同浓度泄浊除痹方总黄酮孵育48h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性;进行尿酸吸收实验,采用尿酸检测试剂盒测定尿酸吸收值。结果显示:高浓度组总黄酮(10、7.5、5 g·L-1)对细胞生长有不同程度的抑制作用,低浓度组药物(2.5、0.5 g·L-1)对细胞生长活性无显著影响;在对细胞生长活性无显著影响的低浓度梯度范围内(2.5、2、1.5、1.0、0.5 g·L-1),药物对尿酸吸收表现出不同程度的抑制作用。该研究表明泄浊除痹方总黄酮对小鼠肾脏近曲小管上皮细胞尿酸吸收功能有一定的抑制作用。 泄浊除痹方总黄酮对RST基因的负性调控:利用分子生物学实验手段检测不同药物作用浓度下,细胞中RST蛋白的基因扩增。结果显示:泄浊除痹方总黄酮在1-2.5 g·L-1浓度范围内对尿酸吸收有显著抑制,且RST基因扩增明显下调。该研究表明泄浊除痹方有能够通过下调RST基因扩增,降低RTECs尿酸吸收作用。
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