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《广州中医药大学》 2011年
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氧化苦参碱抑制结肠癌LOVO细胞增殖及相关机理的实验研究

彭燕  
【摘要】:背景 单味中草药的化学成分,特别是有效单体的研究,是研究复方有效成分的基础。氧化苦参碱(Oxymatrine, OM)为豆科槐属植物苦参(Sophora flavescens Ait.)、苦豆子(S.Alopecuroides L.)、广豆根(S.Subprostrata Chun)等中草药的有效活性成分。氧化苦参碱具有强大的抗肿瘤特性,对多种癌症细胞均具有抗增殖、黏附和移动的作用。既往的研究表明,氧化苦参碱可直接抑制结肠癌细胞SW116、SW480细胞的增殖,诱导其凋亡以及对DNA周期分布具有影响。并有诱导白血病细胞株分化的报道。但对结肠癌细胞株LOVO的作用报道极少。 目的 本研究欲以LOVO细胞为研究对象,探讨OM对LOVO细胞是否具有抑制增殖的作用,并对其作用机理进行初步探讨,为进一步明确OM的抗结肠肿瘤的作用,以及指导临床应用提供实验室依据。 方法 1.取对数期生长的LOVO细胞铺种于96孔板,采用四甲基偶氮畔蓝(MTT)法检测OM对人肝癌细胞株HepG2和大鼠小肠隐窝干细胞株IEC-6的增殖抑制作用。 2.用MTT比色法检测不同浓度OM作用后6h、24h、48h、72h、96h、120h细胞的存活率,与空白对照细胞比较,计算细胞增殖抑制率。 3.用MTT法检测OM对LPS刺激后LOVO细胞过度增殖的影响。 4.显微镜下观察不同浓度OM作用后细胞的形态学变化。 5.流式细胞仪检测不同浓度OM作用后LOVO细胞的凋亡率和细胞周期分布情况。 6.采用RT-PCR技术检测凋亡、粘附相关蛋白及骨架蛋白相关基因的表达情况。 7.用免疫组化检测OM对LOVO细胞凋亡及粘附相关蛋白的表达影响。 8.定量ELISA法检测OM作用后对肿瘤分泌炎症细胞因子的影响。 结果 1.2mg/ml OM和lmg/ml OM对人肝癌细胞株HepG2和大鼠小肠隐窝干细胞株IEC-6均有显著的抑制增殖和杀伤作用。 2.不同浓度OM对LOVO细胞具有不同程度的增殖抑制和杀伤作用,呈剂量依赖关系。2mg/ml OM组有明显时间依赖性,随着时间的延长,细胞浮起、破碎、死亡等表现明显增多;1、0.5、0.25mg/ml OM组作用从6h-72h,对细胞生长的抑制作用明显增加,当作用时间超过72h,对LOVO细胞生长的抑制作用减弱。 3.OM对LPS诱导的LOVO细胞过度增殖有明显的抑制作用。 4.当药物作用6h,各浓度OM与对照组比较均出现G1、S期阻滞趋势;lmg/ml、2mg/ml OM组作用24h,与对照组相比进入G2/M期的细胞增多;2、1、0.5mg/ml加药组作用48h进入G2/M期的细胞较对照组均有增加。 5.0M对LOVO细胞的凋亡率有明显影响。与对照组相比,2mg/mlOM组在24h、48h的凋亡率明显增加(P0.05)。而1、0.2、0.1mg/mlOM组凋亡率有增加的趋势,但无统计学意义。 6.与空白对照组相比,2mg/ml OM组作用24h、48h后,LOVO细胞P53表达均有下调;而100ng/ml TNF-a作用48h, LOVO细胞P53表达上调。在药物作用24h后OCLN (tight junction protein occludin)表达有上调趋势。bcl-2、TUBAIA (tubulin, alpha la)出现下调,较空白对照组细胞有统计学意义(P0.05)。0.25 mg/mlOM组作用48h,c-myc表达下调有统计学意义(P0.05);0.5mg/mlOM组作用48h,c-myc、CDK4表达下调有统计学意义(P0.01); 0.5mg/mlOM组作用96h、c-myc、PSMD9 (proteasome 26S subunit, non-ATPase,9)、CDK4表达下调有统计学意义(其中c-myc表达P0.05、PSMD9、CDK4表达P0.01) 7.在免疫组化检测中,OM对细胞作用24h后,lmg/mlOM组、2mg/mlOM组bcl-2蛋白的表达较空白对照细胞表达明显下调;ocludin蛋白较空白对照细胞表达增加。 8. 1mg/mlOM作用48h后,与对照组相比,其上清中炎症细胞因子IL-6、IL-4、有上升趋势,H-CRP有下调趋势;100ug/mlTNFa组与对照组相比IL-1β、IL-6、IL-4、IL-12、TNFa有上升趋势,IL-4增加显著有统计学意义(P0.05), H-CRP有下调趋势;而OM联合TNF组,与对照组相比,IL-1β、IL-6、IL-4表达上调有统计学意义(其中IL-6 P0.05, IL-1β、IL-4 P0.01), H-CRP表达下调,有统计学意义(P0.05); sTNFa-R在本实验中未检测到。 结论 OM对结肠癌LOVO细胞具有抑制增殖作用,其机理可能与OM能影响LOVO细胞形态、促进LOVO细胞凋亡、使细胞周期停滞在G2/M期、影响P53、bcl-2、TUBAIA、OCLN等基因的表达、影响LOVO细胞分泌IL-1β、IL-6、IL-4、IL-12、TNFa、H-CRP等细胞因子有关,并可能通过增加细胞粘附作用以减少LOVO细胞侵袭、转移来发挥其抗肿瘤的作用。
【学位授予单位】:广州中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R285.5

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【参考文献】
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