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《广州中医药大学》 2011年
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尿毒清颗粒对肾小管上皮细胞—间充质转分化的抑制作用

卢钊宇  
【摘要】:背景 肾小管间质纤维化几乎是所有慢性肾脏病(CKD)进展到终末期肾衰(ESRD)的共同途径,大量的临床和实验研究表明,在各种原发性和继发性肾脏疾病中,TIF的程度与肾功能的相关性比肾小球硬化与肾功能的相关性更为密切,是反映肾功能下降严重程度和判断预后最重要、最准确的指标。 最近研究证明肾小管上皮细胞-间充质转分化(EMT)是肾小管间质纤维化关键的发病机制,出现肾小管上皮细胞表型转换成为肌纤维母细胞。肾小管间质中肌纤维母细胞的激活导致细胞外机基质特别是胶原蛋白的过度产生,从而在慢性肾脏病的进展中发挥着重要作用。 因此,肾小管上皮细胞-间充质转分化是具有重大意义的治疗靶点,抑制肾小管上皮细胞-间充质转分化能够延缓肾小管间质纤维化进程。 中医药治疗慢性肾脏病已有数千年历史,部分中草药已经被证实具有抗纤维化保护肾脏作用。但是目前关于中草药延缓慢性肾脏病进展仍缺乏系统性研究,寻找能够抑制EMT的中药将为慢性肾脏病的治疗提供新的方法。 尿毒清颗粒是由广州康臣公司生产的中药复方制剂,由大黄、黄芪、丹参、白术、白芍和首乌等组成。尿毒清颗粒延缓慢性肾功能不全进展方面临床治疗有效,但是其作用的细胞、分子机制不清,缺乏令人信服的实验依据。 目的 观察尿毒清颗粒对动物模型和细胞模型肾小管上皮细胞-间充质转分化的抑制作用,探讨尿毒清颗粒对肾小管间质纤维化的抑制作用,为尿毒清颗粒延缓慢性肾脏病进展提供理论依据。 方法 一、采用回顾性研究方法,依据纳入、排除标准筛选我院2008年1月份至2009年12月份住院慢性肾脏病3-5(非透析)期患者,分析符合纳入标准的慢性肾脏病患者的中医证侯分布规律,尿毒清颗粒的使用情况。 二、动物实验:SD大鼠50只,分为假手术组(10只)、UUO模型对照组(20只)、UUO尿毒清治疗组(20只)。假手术组大鼠仅切开腹腔并游离左侧输尿管,但不予结扎和剪断。UUO模型组和UUO尿毒清治疗组大鼠于左侧输尿管中上1/3处用4号线上下结扎两处,制备UUO单侧输尿管梗阻大鼠模型。术后UUO尿毒清治疗组大鼠予尿毒清颗粒灌胃治疗,余大鼠予同等剂量生理盐水灌胃。术后7天、14天两个时间点结束实验。肾脏Masson染色明确各组大鼠肾脏纤维化程度。免疫荧光染色检测各组大鼠肾组织E-cadherin、Vimentin和α-SMA表达定位;Western blot法检测各组大鼠肾组织E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白质的表达。 三、细胞实验:制备尿毒清大鼠含药血清,检测正常大鼠血清、尿毒清大鼠含药血清对体外培养肾小管上皮细胞(HK-2)有无毒性作用。予TGF-β1 (10ng/ml)诱导体外培养肾小管上皮细胞向间充质转分化,倒置相差显微镜观察细胞表型变化,细胞免疫荧光法检测E-cadherin、Vimentin的表达定位;Western blot法检测细胞E-cadherin和Vimentin表达的变化。观察尿毒清大鼠含药血清能否抑制TGF-β1诱导细胞表型、分子表型的变化。 结果 一、共纳入193例住院慢性肾脏病3-5(非透析)期患者,通过对193例CKD3-5(非透析)期患者的中医证侯分析,我们发现慢性肾脏病患者中医证型主要为脾肾气虚,湿浊瘀阻和脾肾气虚,湿热瘀阻。而尿毒清颗粒的使用率也达到80.1%。 二、动物实验: 1、尿毒清颗粒能够抑制UUO单侧输尿管梗阻大鼠肾小管间质纤维化程度。肾脏病理结果提示UUO模型组大鼠7天出现肾小管扩张、小管萎缩、间质增宽和小管间质纤维化,14天时大部分小管受损。尿毒清颗粒能够改善UUO单侧输尿管梗阻大鼠的病理改变。与UUO模型组相比,UUO尿毒清治疗组大鼠肾小管间质纤维化半定量积分7天和14天分别下降17.5%±1.1%和20.0%±1.2%(P0.05)。 2、尿毒清颗粒抑制单侧输尿管梗阻大鼠肾小管上皮细胞-间充质转分化。免疫荧光与Western blot结果显示:假手术组大鼠肾小管上皮细胞正常表达E-cadheirn,几乎不表达Vimentin,而α-SMA仅表达于血管平滑肌细胞。UUO大鼠7天开始出现肾小管上皮细胞E-cadheirn表达减少,间质Vimentin、α-SMA表达增多,至第14天E-cadherin表达更加减少,Vimentin、α-SMA表达更加增多。尿毒清颗粒能够抑制UUO大鼠7天和14天出现的肾小管上皮细胞E-cadherin表达下调、Vimentin和α-SMA表达上调(P0.05)。 三、细胞实验 1、正常大鼠血清、尿毒清大鼠含药血清对体外培养HK-2细胞无明显细胞毒性,能够用于后续实验。 2、TGF-β1 (lOng/ml)培养48或72h能够诱导肾小管上皮细胞-间充质转分化,表现为细胞伸长呈菱形,细胞相互分离,失去鹅卵石样生长状态。免疫荧光与Western blot结果显示细胞膜蛋白E-cadherin表达下调,胞浆Vimentin表达上调(P0.01) 3、5%和10%尿毒清大鼠含药血清均能够拮抗TGF-β1诱导体外培养肾小管上皮细胞表型改变,能够维持E-cadherin的表达,抑制Vimentin的表达,抑制肾小管上皮细胞-间充质转分化(P0.05)。 结论 1、193例住院慢性肾脏病3-5(非透析)期患者脾肾气虚、湿浊瘀阻和脾肾气虚、湿热瘀阻证型占有很大比例,而尿毒清颗粒的使用率也达到80.1%。尿毒清颗粒组方符合中医证型分布,但是其作用的分子、细胞机制尚未明确,拟进行后续动物、细胞实验。 2、UUO大鼠7天及14天出现典型的肾小管-上皮细胞间充质转分化(EMT)表现,即E-cadherin表达减少,Vimentin、α-SMA表达上调。尿毒清颗粒能够部分抑制UUO大鼠肾小管上皮细胞-间充质转分化,从而延缓UUO大鼠肾小管间质纤维化进程。 3、与胎牛血清相比,健康大鼠血清及尿毒清含药血清对HK-2细胞无明显毒性作用,能够用于细胞实验。TGF-β1能够诱导肾小管上皮细胞发生转分化,表现为细胞伸长成棱形,E-cadherin表达下调,Vimentin表达上调。5%及10%尿毒清含药血清均能部分抑制TGF-β1诱导肾小管上皮细胞表型改变,能够上调E-cadherin表达,抑制Vimentin表达。
【学位授予单位】:广州中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R285

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