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《广州中医药大学》 2012年
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热打击致肠上皮细胞损伤机制的中西医研究

袁芳芳  
【摘要】:目的 通过离体细胞和分子水平,研究热打击对肠上皮细胞和细胞间连接的影响,为阐明肠机械屏障损伤在中暑肠道病变中的可能作用机制提供实验依据。 方法 1.热打击对肠上皮细胞形态与细胞骨架的影响 体外培养正常大鼠肠上皮细胞株(IEC-6)细胞,按不同程度热打击进行实验分组:即将细胞分别置于39℃、41℃、43℃热打击1h,对照组为将细胞置于37℃条件同各热打击组等时间培养,置于倒置显微镜下观察细胞形态;考马斯亮蓝R250染色,油镜下观察细胞形态的改变及骨架蛋白在不同程度热打击下的变化,并照相。 2.热打击对肠上皮细胞细胞活力的影响 体外培养正常大鼠肠上皮细胞株(IEC-6)细胞,按不同程度热打击进行实验分组:即将细胞分别置于39℃、41℃、43℃热打击0、1、3、5、7h,对照组为将细胞置于37℃条件同各热打击组等时间培养,于各时间点在相应分组的培养细胞上清中加入CCK-8后,并重新置于标准37℃、5%C02培养箱中孵育2h,用酶联免疫检测仪在450nm处读取吸光度值(A)值,计算细胞活性。 3.热打击对肠上皮细胞内切酶DAO活性的影响 体外培养正常大鼠肠上皮细胞株(IEC-6)细胞,按不同程度热打击进行实验分组:即将细胞分别置于39℃、41℃、43℃热打击1h,对照组为将细胞置于37℃条件同各热打击组等时间培养,待24h后,收集培养上清ELISA法检测DAO活性。 4.热打击对肠上皮细胞细胞旁通透性的影响 体外培养正常大鼠肠上皮细胞株(IEC-6)细胞,按不同程度热打击进行实验分组:即将细胞分别置于39℃、41℃、43℃热打击1h,对照组为将细胞置于37℃条件同各热打击组等时间培养,用Millicell-ERS系统检测跨上皮电阻(TEER)。 5.热打击对肠上皮细胞细胞紧密连接的影响 体外培养正常大鼠肠上皮细胞株(IEC-6)细胞,按不同程度热打击进行实验分组:即将细胞分别置于39℃、41℃、43℃热打击1h,对照组为将细胞置于37℃条件同各热打击组等时间培养,24h后收集细胞蛋白,用Western blotting方法检测细胞Occludin蛋白表达水平。 结果 1.热打击对肠上皮细胞形态与细胞骨架的影响 光镜下可见,热打击可使肠上皮细胞(IEC-6)轮廓变圆,伪足变短变粗,细胞间间隙增宽,且随着热打击程度的增加,上述表现越加明显,至43℃时部分细胞出现坏死。考马斯亮蓝R250染色法检测发现,热打击可导致IEC-6细胞骨架变粗、变短、紊乱,出现明显的应力纤维,排列呈明显的非极性单向分布。且温度越高,变化越明显。 2.热打击对肠上皮细胞细胞活力的影响 CCK-8试验显示,热打击可造成IEC-6细胞活性下降,且随热打击程度的加深,细胞活性下降越明显,各热打击组均较正常对照组显著下降(P<0.01)。 3.热打击对肠上皮细胞内切酶DAO活性的影响 ELISA检测结果显示,热打击后细胞培养上清中DAO活性增高,温度越高变化越明显,四组之间比较差异具有统计学意义(P0.01);39℃热打击组与对照组比较,P﹤0.05;39℃热打击组与41℃和43℃热打击组比较,P<0.05。 4.热打击对肠上皮细胞细胞旁通透性的影响 TEER检测结果显示,热打击可造成TEER水平降低,温度越高下降越明显,各热打击组与正常对照比较具有统计学意义(P<0.05),各热打击组之间比较亦有显著差异(P<0.01),表明热打击可引起肠粘膜通透性增加,并呈温度依赖性。 5.热打击对肠上皮细胞细胞紧密连接的影响 Western blotting结果显示热打击后紧密连接蛋白Occludin表达增多,且随温度升高而增多,各组之间Occludin表达量比较具有统计学意义P<0.05) 结论 一方面,热打击对肠上皮细胞造成直接损伤,可引起肠上皮细胞活力下降,甚至引起细胞内结构破坏。另一方面,热打击还可导致细胞间通透性的增加,主要表现为热打击可造成细胞骨架蛋白改变、细胞跨上皮电阻下降。但在我们的研究中还发现,热打击可以导致细胞间紧密连接蛋白关键成员——Occludin表达增加,我们推测Occludin在此过程中可能起到了应激修复作用。
【学位授予单位】:广州中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R363

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