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β- 细辛醚对LPS刺激的RAW264.7细胞HMGB1和NF-κB表达的影响

吴晶晶  
【摘要】:研究目的: 脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)通过细胞表而Toll样受体激活细胞内以核转录因子κB(NF-κB)为核心的炎症信号通路,产生大量的炎症因子,这些炎症因子通过相应的受体反复激活细胞内炎症信号通路,产生严重的炎症级联反应。其中,高迁移率族蛋白-1(HMGBl)是内毒素休克晚期致死效应的重要炎症介质。 β-细辛醚是石菖蒲的主要活性成分之一,具有多种药理活性。石菖蒲为天南星科多年生草本植物石菖蒲(Acorus tatarinowii Schott)的干燥根,味辛性温,具芳香之气,为宣气通窍之佳品。临床上主要用于热病神昏、癫狂、痰厥、健忘、痴呆、耳聋、耳鸣、心胸烦闷、跌打损伤等,可能与神经系统、心血管系统等疾病的炎症反应有关,但是目前关于β-细辛醚在抗炎方面的实验研究较少。为了充分挖掘β-细辛醚的药用价值,本研究通过LPS刺激小鼠单核-巨噬细胞株RAW264.7建立细胞模型,采用western-blot.荧光免疫组化等实验方法,研究β-细辛醚对晚期炎症因子HMGB1和炎症因子转录相关的NF-κ B表达的影响。 研究方法: (一)p-细辛醚对LPS刺激的RAW264.7细胞HMGB1表达的影响 1.确定LPS刺激的RAW264.7细胞模型:实验分为对照组、0.1μg/mlLPS刺激24h组、().1μg/mlLPS刺激36h组、0.1μg/mlLPS刺激48h组、0.2μg/mlLPS刺激24h组,用Cy3(红色荧光)标记HMGB1, Honchest33258(蓝色荧光)标记细胞核,荧光显微镜和共聚焦显微镜观察HMGB1在细胞核或细胞质中的表达部位,根据HMGB1核转位情况和细胞活性情况确定LPS的量与刺激时间。 2.荧光免疫组化方法检测HMGB1表达部位:采用0.2μg/mlLPS刺激RAW264.7细胞24h模型,并将细胞分为对照组、模型组、β-细辛醚(15μM)及β-细辛醚(150μ M)共四组,对照组不做任何处理,模型组及药物组使用0.2μ g/mlLPS刺激,药物组加入不同浓度的β-细辛醚。同上法用观察HMGB1的表达部位,分析β-细辛醚对HMGB1表达部位的影响。 3. Western blot方法检测细胞核内IIMGB1农达:同上设立实验各组,用分步裂解提取法提取细胞核蛋白,Western blot方法检测HMGB1表达,核蛋白以LaminB作为内参照。 (二)β-细辛醚对LPS刺激的RAW264.7细胞NF-κ B表达的影响 1. Western blot方法检测NF-κ B表达:同上设立实验各组,裂解细胞提取法提取细胞总蛋白,Western blot方法检测NF-κ B表达,以GAPDII作为内参照。 2.双荧光素酶报告方法检测NF-κ B启动子活性:NF-κ B启动子报告基因质粒Luc2P/NF-κ B-RE/Hygro转染RAW264.7细胞,以沁肾荧光素酶的对照质粒PRL SV40作对照,同上设立实验各组,采用双荧光素酶报告系统检测β-细辛醚NF-κ B启动子活性的影响。 研究结果: (一)β-细辛醚对LPS刺激的RAW264.7细胞HMGB1表达的影响 1.免疫荧光组化结果显示,LPS(0.1μ g/ml)刺激RAW264.7细胞48h和LPS(().2μg/ml)刺激RAW264.7细胞24h后,细胞质呈较明亮的红色,表明细胞质中有较多HMGB1表达。确定以LPS(0.2μg/ml)刺激RAW264.7细胞24h作为后续实验细胞模型。 2.免疫荧光组化结果显示,15μM和150μMβ-细辛醚组细胞质均有红色荧光;15μM组细胞质内红色荧光表达较强,细胞核呈蓝色荧光;150μMβ-细辛醚组细胞质内红色荧光表达较弱,细胞核呈桔红色(为蓝色与红色荧光的叠加);表明15μM和150μMβ-细辛醚组均可减少细胞质中HIMGB1而增加细胞核中HMGB1表达,150μMβ-细辛醚组比15μM组更为显著。 3. Western blot结果显示,核蛋白以LaminB为内参,模型组HMGB1条带变细,与空白对照组相比较有显著性差异(P0.05);15μMβ-细辛醚组与模型组相比无统计学差异;150μ M β-细辛醚组HMGB1条带变粗,经统计学处理与模型组相比有显著性差异(P0.05),表明150μ M β-细辛醚组细胞核内的HMGB1蛋白表达水平高于模型组。 (二)β-细辛醚对LPSI刺激的RAW264.7细胞NF-κ B表达的影响 1. Western blot结果显示,在0.2μ g/mlLPS刺激24h后NF-κ B的蛋白表达水平明显高于空白对照组,有特别显著性差异(P0.01)。15μ M和150μM β-细辛醚组NF-κB表达都比LPS组明显下降,有特别显著性差异(P0.01);150μM β-细辛醚组下降更为显著。结果表明,β-细辛醚有抑制NF-κ B蛋白表达作用,目.随剂量增大抑制作用增强。 2.双荧光素酶报告基因检测系统结果显示,LPS组NF-κ B启动子荧光素酶活性RLA与空白对照组相比明显增强,有特别型著性差异,说明NF-κ B报告基因转染成功。15μ M β-细辛醚组NF-κ B荧光素酶活性RLA比LPS组下降,有型著性差异;150μMβ-细辛醚组下降更为明显,有特别显著性差异。结果表明,β-细辛醚有抑制NF-κ B启动子活性作用,且随剂量增大抑制作用增强。 研究结论: 1.150μMβ-细辛醚可显著增加HMGB1在细胞核内的表达。 2.15μM和150μM β-细辛醚均可显著减少NF-κ B表达,可显著抑制NF-κ B启动子活性,且随剂量增大抑制作用增强。


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