青天葵组织培养与原生质体分离的研究

【摘要】：青天葵[Nervilia fordii (Hance) Schitr.]是我国珍稀濒危植物,主要以球茎进行繁殖,繁殖系数极低,加之多年来灭绝式的挖掘,导致野生青天葵资源日益枯竭。而国内外市场的需求量却逐年加大,野生青天葵己远远满足不了市场的需求。因此,组织培养与人工种植成为保护野生青天葵资源和解决供需矛盾的有效途径。建立该植物扩繁体系可为其药材野生品种转家种,进行人工栽培提供技术基础。为建立更加稳定完善的青天葵扩繁体系,本研究在前期研究结果基础上进行了优化。 细胞悬浮培养可直接用于原生质体分离、培养与杂交、基因转移和生产次生代谢物等。本实验在成功获得稳定的青天葵愈伤组织培养体系的基础上,对青天葵悬浮细胞培养进行了初步研究,取得初步进展。 组织培养和人工种植是保护野生青天葵资源和解决供需矛盾的有效途径,而组培再生植株与人工种植植株的品质如何,能否真正替代野生青天葵,尚缺乏系统的研究。由于在前期实验中已成功培养得到青天葵组培球茎,因此,将组培球茎同栽培青天葵进行解剖结构及化学成分比较,以研究青天葵组培物与人工栽培植株的差异。 同时,本研究尝试以青天葵叶片为材料,进行原生质体分离,为青天葵转基因、原生质体融合及青天葵生物学基础理论研究提供新的实验体系。 本论文主要研究结果如下： 1、以青天葵新鲜球茎为外植体,发现1.0g.L-1升汞溶液处理球茎10min、玻璃培养皿有利于青天葵球茎的诱导；青天葵走茎及愈伤组织在M③(MS+1.0mg·L-16-BA)培养基中培养可得到大量丛生芽及愈伤组织,多次继代培养可得到完整植株；组培苗基本生长模式为：球茎外植体一白色走茎一绿色走茎一组培球茎一组培苗。但该过程历时久,组培苗生长力较弱,尚不具备炼苗下田和批量生产的条件。 2、经过多次继代培养,得到生命力强、颗粒状、疏松易碎的浅黄白色胚性愈伤组织；愈伤细胞在1／4MS和1／2MS培养基上生长良好,优于其他培养基；1／2MS组培养物干重增加率最大,MDA含量最低,POD含量最高,说明此种培养基适宜青天葵愈伤组织的生长和有机物的积累；光照悬浮培养有利于愈伤组织总黄酮含量的积累,而暗培养条件有利于愈伤组织干重增加率的增加；当以获得大量培养物为目的时可调整液体培养基蔗糖浓度为1%,当以获得黄酮类化学成分为培养目的时可将蔗糖浓度增加至3%；调培养基pH值为6.0,并添加1.0g·L-1MES,可能增加青天葵愈伤组织悬浮培养物的干重增加率及总黄酮含量。 3、经过对比发现,青天葵组培物与栽培植株之间主要存在以下差异：组培芽横切面明显可见维管束10束,导管不明显,呈不规则环状排列,中部维管束不甚明显,栽培植株走茎维管束为6束,维管束与周围薄壁细胞区分不显著,而维管束中的导管清晰可见；组培物中未见草酸钙针晶束和内生菌,栽培植株中针晶束较多,有内生菌分布；组培球茎维管束3束,清晰可见,栽培植株球茎维管束不明显。经过LC-MS检测后发现,青天葵组培物中可能含有比栽培植物更多的化学成分,但是由于受实验材料、时间等限制,未能对其进行定性,有待于后期的深入研究。 4、适宜青天葵叶片原生质体分离的条件是：1.0%纤维素酶R-10+0.6%离析酶R-10的混合酶液酶解12h,在此条件下原生质体产量达6.85×106(个/g),存活率为92.91%；适宜青天葵叶片原生质体游离的条件是：13%甘露醇溶液预处理叶片1h、酶解温度(25±1)℃、黑暗、静置；原生质体纯化采用离心沉淀法,以200目细胞筛网过滤后800rpm离心8min,重复操作2次,可得到大量完整清晰、细胞碎片少的原生质体。