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《广州中医药大学》 2012年
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基于rDNA ITS序列分析的石斛属种内及种间鉴别

李海霞  
【摘要】:石斛类药材应用历史悠久,具有滋阴清热、润肺止咳、生津益胃等功效。在《神农本草经》当中被列为“上品”药材,具有较高的经济价值。多年来,由于对石斛资源的需求量巨大,许多地方均开展了对石斛进行大规模人工栽培的研究。铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimur et Migo)具有增强免疫力、降低血糖、抗衰老、抗肿瘤等活性,可用于胃肠道、白内障、关节炎和慢性咽炎等疾病的治疗,在癌症放化疗患者的康复治疗中应用广泛。在石斛新品种选育及资源开发研究中,对物种身份进行准确的鉴定极为重要。由于商品石斛种类繁多、基源复杂,药材在加工炮制过程中,形态、性状会发生变化,导致传统的以形态学为主的鉴定方法在实际应用中显得捉襟见肘。 基于核酸序列分析的DNA条形码技术的出现,为快速准确地鉴定样品物种的身份带来了希望。位于核基因具有多拷贝的内转录间隔区(Internal transcribed spacer, ITS),已广泛用于种内和种间亲缘关系分析。ITS区依次包括ITS1、5.8S, ITS2,位于其两端的18S和26S因较为保守,通常以之为模板设计引物,对ITS进行扩增。 目的: 通过对野生铁皮石斛样品的4段候选序列(叶绿体基因psbA-trnH、matK、rbcL;核ITS序列)进行筛选,用筛选出来的序列结合GenBank数据库中所有已知的代表性的同源序列进行多重序列比对和亲缘关系分析,同时通过寻找特异性的碱基变异位点,从种内和种间2个层面,探讨利用DNA序列分析方法推测铁皮石斛产地可行性及石斛属植物分组鉴别的可行性。为铁皮石斛优良品种选育和引种驯化提供理论依据。 方法: 一、DNA测序方法:将所有植物材料用无菌水冲洗干净,晾干剪碎后用硅胶干燥,各称取0.05g,经液氮研磨后,用天根DP305离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒提取总基因组DNA。利用引物对上述样品进行PCR扩增。取3μL PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳上检测,经Wizard试剂盒纯化后送是中国农业科学院作物科学研究所开放实验室进行双向测序。 二、数据分析方法:序列拼接和校对使用Codoncode Aligner3.7.1,用Bioedit7.0中的ClustalW进行多重序列比对,用MEGA5.0中的Kimura2-parameter模型计算遗传距离,构建系统发育树,所有对位排列结果中的空位或缺失数据作完全删除处理,系统树各分支的置信度以自举检验法(bootstrap test)检验。 成果: 数据提交:预实验发现仅ITS有3个变异位点,其他3条序列无变异位点,故选择ITS序列作为本研究的对象。从测定的所有ITS序列中选择11条提交GenBank,已获得登录号JF803235-JF803245。参考已知的石斛属植物ITS序列及相关文献报道,精确定位了所有测定的ITS序列的起止位置并进行了编号。 种内分析:对所有铁皮石斛ITS序列的起止位置进行精确定位和编号,共发现645个同源位点,9个信息位点(ITS1区3个,5.8S区4个,ITS2区2个)。系统发育分析发现,金钗石斛和密花石豆兰位于树的基部,另外32条铁皮石斛共同形成了单个大的分支。未发现产地来源与系统树的拓扑结构之间存在明显的对应关系。 种间分析:对石斛属66条ITS序列以及外群密花石豆兰和云南石仙桃构建NJ系统发育树发现,12组中7、8、9、10、11、5这6组形成稳定的分支,与传统分类方法一致,另外6组分布较散。 结论: 由于缺乏完善的铁皮石斛标准品及其DNA参考序列的提交标准,同时单个ITS序列仅能提供有限的系统发育信息位点,因此通过ITS序列分析的方法推测铁皮石斛样品的产地来源目前尚不具有可行性。 利用ITS序列构建的石斛属系统进化关系与传统分组有一定的差异,拓扑结构与组间不存在完全一一对应的关系,说明利用此种方法暂时无法对未知物种进行组间的鉴别。但在提高物种鉴定技术、完善序列提交体系的情况下,利用ITS序列构建系统进化树对石斛属植物分组鉴别是有很大希望的。
【学位授予单位】:广州中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S567.239

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