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《广州中医药大学》 2012年
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青蒿醛脱氢酶基因克隆及青蒿琥酯抗菌增敏作用研究

肖娜  
【摘要】:目的: 青蒿素以高效抗疟作用最为著名,但它也具有抗肿瘤、抗炎症(自身免疫病)等多种功效。由于世界市场供应的青蒿素主要来自我国人工种植的青蒿,其青蒿素含量偏低,生产成本较高,加之种植规模逐年萎缩,因而难以完全满足全球疟疾感染者对青蒿素类抗疟药的庞大需求,于是利用基因工程微生物大规模生产青蒿素成为当前最有希望的解决方案。本研究还对青蒿琥酯的抗菌作用进行了分子药理学评价,为利用抗生素增敏剂克服“超级细菌”日益严重的抗生素耐药性提供新思路。 方法: 本研究从青蒿中克隆了一个新的青蒿素前体合成基因——青蒿醛脱氢酶基因-1(ALDH1),并经双酶切、扩增和重测序予以确认。通过构建pESC-ALDH1表达载体(含尿嘧啶合成基因)并导入酿酒酵母YPH501菌株(尿嘧啶缺陷型)后,获得能在SD-U(尿嘧啶缺陷培养液)中生长的转化子。将酵母工程菌培养48-72h后,加入半乳糖处理12h诱导ALDH1基因表达,由青蒿试管苗制备无细胞提取液,对酵母发酵产物进行生物转化。 在青蒿琥酯抗菌增敏作用研究体外实验中我们检测经过缺氧适应的地衣芽孢杆菌产生的NO值和生长状态(OD值)以及单纯添加抗生素和抗生素和青蒿琥酯联用时NO值和过氧化氢酶活性。在体内实验中以大肠杆菌和地衣芽孢杆菌分别作为革兰氏阴性菌(G-)和阳性菌(G+)的代表,通过粪便菌落培养和计数或血清NO含量测定,在活菌饲喂导致肠道细菌感染的小鼠中评价了青蒿琥酯对抗生素的体内增敏效果。 结果: 通过气象色谱-质谱分析可见,转化样品中的青蒿素含量高于对照样品,初步证实青蒿ALDH1基因已在酵母细胞中实现功能表达。 青蒿琥酯抗菌作用体外实验结果可见青蒿琥酯与一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NMMA一样,可阻断缺氧及缺氧+冷处理诱导的细菌一氧化氮(NO)合成,也能抑制细菌过氧化氢酶(CAT)活性。体内实验可见,青蒿琥酯不仅能提高头孢菌素对G-细菌和利福平对G+细菌的杀伤效果,而且还可辅助氨苄青霉素抑制抗药性细菌的繁殖。 结论: 以上结果为进一步创建青蒿素全合成微生物平台奠定了基础,为克服“超级细菌”的抗生素抗性提供了新思路。
【学位授予单位】:广州中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R285

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