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《广州中医药大学》 2012年
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乙烯利刺激檀香结香及其作用机制研究

邓瑞云  
【摘要】:目的: 檀香自然生长情况下需十年以上才能结香(形成含萜烯类挥发油的心材),三十年以上才能药用。因此对5年生檀香植株进行乙烯利刺激结香试验,重点研究檀香结香过程萜烯类合成酶基因及其功能表达,逐步阐明檀香芳香心材形成的分子机理,从而为显著缩短檀香生产周期以及我国檀香资源可持续发展提供科学依据和技术保障。 方法: 采用打孔法注射不同浓度乙烯利进行檀香刺激结香试验;GC-MS法和HPLC法分析檀香心材刺激前后组分和含量变化情况;根据GenBank公布的檀香萜烯合成酶基因序列设计特异性引物,CTAB-LiCl法提取檀香心材总RNA,采用RT-PCR技术获得檀香TPS1基因,并与PGM-T载体进行连接转化得到克隆质粒;采用PCR扩增获得目的基因,与空载体pET-32a(+)分别经过双酶切(EcoR V,Sac I)处理,连接转化E.coliDH5a感受态细胞,获得重组质粒,将携带有目的基因的重组质粒转化E.coli BL21宿主菌,用IPTG进行诱导表达;采用SDS-PAGE电泳对蛋白表达结果进行分析;表达产物经纯化后,加入到以FPP和GPP为底物的体外酶促反应体系中,正己烷萃取最终反应产物,并采用GC-MS分析鉴定。 结果 1乙烯利刺激结香试验 经乙烯利刺激过的檀香心材颜色明显深于水对照组,3%浓度组颜色深于2%浓度组;上下5cm的颜色深于上10cm所取心材。乙烯利刺激组粉末闻之有芳香气味,而对照组闻之无芳香气味。 三个组檀香心材粉末的显微特征基本一致,在显微镜下均能观察到以下结构:韧型纤维、纤维管胞、具缘纹孔导管、木射线。3%浓度组显微特征观察有大量堆积的黄棕色分泌物,2%浓度组只有少量散在黄棕色分泌物,水对照组则无。 2化学成分分析 刺激结香试验进行1年半后取样分析,经过乙烯利刺激后的檀香含有挥发油,水对照组不含挥发油。通过对主要峰进行质谱分析,发现四个主要峰都是檀香挥发油中的主要成分,它们分别是α-檀香醇、α-佛手醇、E顺式,Epi-β-檀香醇、β-檀香醇。不论从檀香挥发油总量还是单个组成的含量来看,经3%乙烯利刺激的檀香挥发油均明显高于经2%乙烯利刺激的;从不同部位样品所含挥发油平均值分析结果来看,刺激部位5cm上和5cm下挥发油含量差异不明显,而5cm上部位的檀香挥发油含量要高于10cm上的,从α-檀香醇和β-檀香醇含量之和来看,2%乙烯利刺激的两者之和不到20%,而经3%乙烯利刺激的两者之和达到67%(5cm上部位)。 刺激结香试验进行3年后取样分析,水对照组以及未经任何处理方式的自然结香组均含有了挥发油,但含量不及乙烯利刺激组和对照药材,除水对照组外其他各组挥发油成分仍以α-檀香醇、α-佛手醇、E-顺式,Epi-β檀香醇、β-檀香醇为主,四个成分在各组挥发油组分中所占百分比以自然结香组最高,达到88.794%,其次为对照药材与3%乙烯利刺激组,两组均为71.000%,2%乙烯利刺激组为44.796%,水对照组虽含有挥发油,但其挥发油成分中主要成分是二丁基羟基甲苯(34.715%),α-檀香醇、α-佛手醇、E顺式,Epi-β-檀香醇、β-檀香醇四个成分仅占24.133%,且水对照组中N-棕榈酸与9-硬脂酸所占比例也很高。 3檀香TPS基因克隆 PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,在约1.8kb大小的位置有一条带,与预期片段大小一致。采用同源克隆的方法,克隆获得了一个檀香萜类生物合成关键酶一萜烯合成酶基因,序列全长为1812bp的序列,含有1731bp编码区,编码576个氨基酸残基,重命名为TPS1。利用NCBI中的BLSATn进行序列比对,发现该序列与已在GenBank登录的一个同样来自于檀香(白檀)单萜合成酶基因序列(EU798692)同源性为99%。 4原核表达质粒的构建 酶切和测序结果表明,成功构建了携带檀香TPS1基因的原核表达质粒。 5融合蛋白的表达 SDS-PAGE分析结果显示,携带目的基因的重组质粒经IPTG诱导后表达出目的蛋白,主条带在72~95kDa之间,分子量大小符合预期。超声破碎后,目的蛋白虽然大部分仍以包涵体形式存在于沉淀中,但上清中也能检测到目的蛋白,即目的蛋白有部分以可溶性方式表达。 6融合蛋白功能分析 GC-MS分析酶催化反应后的产物,结果显示两个底物的阳性组与阴性对照组图谱均无区别,将图谱进行比对,结果显示阳性组和阴性对照组图谱完全吻合。 结论 1通过不同浓度乙烯利刺激檀香结香试验发现,两种浓度的乙烯利刺激均能有效促进檀香结香,但是经3%乙烯利刺激的檀香结香效果要优于经2%乙烯利刺激的檀香,乙烯利刺激后檀香挥发油含量有距离刺激之处越远含量越小的趋势。 刺激三年后,乙烯利刺激组的挥发油组成成分发生了较大变化,2%和3%乙烯利刺激组挥发油不论在组成成分或是含量上已基本与20年生对照药材挥发油成分达到-致。未经任何刺激的自然结香组挥发油组成成分及含量已与第一次取样的乙烯利刺激组样品挥发油组成成分基本一致。 2克隆获得了一个檀香萜烯类生物合成关键酶——萜烯合成酶基因,该基因序列测序后全长为1812bp,含有1731bp编码区,编码576个氨基酸残基,重命名为TPS1,与已登录NCBI的相关序列同源性高于99%。 3成功构建了原核表达质粒pET32a-TPS1,经IPTG诱导后主要以包涵体表达,只能表达少量可溶性蛋白,通过改变表达宿舍菌和优化诱导条件,增加了可溶性蛋白的表达,使后续纯化试验得以顺利进行。 4纯化后的融合蛋白经活性分析,该融合蛋白酶暂未能显示催化作用,其原因有待进一步深入研究。
【学位授予单位】:广州中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R284

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