降糖三黄片对高糖诱导的心肌细胞TGF-β1调控的影响及临床研究

【摘要】：第一部分文献研究 糖尿病(diabetes mellitus, DM)是由遗传和环境因素共同引起的一组以糖代谢紊乱为主要表现的临床综合征。全世界的糖尿病患病率迅速增加,发展中国家尤为明显,已经成为临床上的主要内分泌代谢病。据国际糖尿病联盟(IDF)估计,截至2025年,我国糖尿病患者人数将达到5930万[1]。糖尿病心脏病(Diabetic Cardiopathy, DC),是指糖尿病合并或伴发的心脏病变,此病名于1979年由Ledet首先提出,很快得到世界同行专家认可。该病包括冠状动脉粥样硬化性心脏病、糖尿病性心肌病、微血管病变和植物神经功能紊乱所致的心律失常等[2]。这几种病变常共同存在,互为因果,相互促进,形成恶性循环。大动脉的粥样硬化(颈动脉、主动脉、股动脉)增加了心肌梗塞、中风及截肢的危[3]。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy)首先由Rubler等在解剖患有充血性心力衰竭的糖尿病患者尸体时提出的[4],其病理表现主要为心脏微血管病变、心肌代谢紊乱和心肌纤维化等所致的心肌广泛结构异常,最终引起左心室肥厚、舒张期和(或)收缩期功能障碍的一种疾病状态[5]。对于心肌细胞的探索,目前已成为糖尿病心肌病的研究热点,利用培养的心肌细胞,探索非血液动力学因素所致的心肌肥厚的调节,研究心肌细胞的生物力学、凋亡、受体下调、缺血和处理、信号通路,对作用于心脏的新药进行筛选并对其安全性进行评价,以及从培养的心肌细胞中提取有价值的生物因子,同药物诱导干细胞分化而成的心肌细胞作阳性对照等。 中医中药对糖尿病心脏病的治疗越来越受到学术界的重视,中药处方以其显著的疗效,低廉的成本,较少的副作用深受患者青睐。以熊曼琪教授为首的研究课题组在上世纪80年代围绕气阴两虚、瘀血阻滞为病机,以《伤寒论》中桃核承气汤为底方,研制成院内制剂——降糖三黄片,在临床及机理研究方面都取得了较大的进展,本实验在诸研究基础上进一步探讨降糖三黄片在分子细胞水平的生物学机制。 第二部分实验研究 目的：观察降糖三黄片对高糖诱导下心肌细胞凋亡率影响,观察心肌细胞TGF-β1表达,进一步从信号通路角度探讨降糖三黄片的作用机理。 方法： 1.提取含药血清。普通级雄性新西兰兔8只,随机分为正常组2只,降糖三黄片低剂量组2只、中剂量组2只、高剂量组2只,普通饲料适应性喂养3天,降糖三黄片低剂量组,予0.75g／kg灌胃；中剂量组予1.5g／kg灌胃；高剂量组予3g／kg灌胃,正常组灌入等量蒸馏水。灌服1周后,禁食12h,腹主动脉采血,提取含药血清。-70℃冰箱冻存。 2.心肌细胞培养及鉴定。Wistar雄性出生3天乳鼠,取心脏组织,0.25%EDTA消化过夜,15h后,予等量全培中止消化,予胶原消化酶Ⅱ消化,将心肌细胞与红细胞充分分离,将心肌细胞按5×105/mL移至12孔细胞培养板中。入37℃二氧化碳培养箱培养。24h后,可见心肌细胞自行跳动,且生长成片,予Desmin免疫组化鉴定,1:100Desmin组胞浆中有棕黄色颗粒的阳性细胞占总细胞数85%左右,磷酸缓冲液(PBS)阴性对照组未见阳性细胞,则成功培养心肌细胞。 3.流式细胞仪检测细胞凋亡。将700ul含葡萄糖(33mmol/L)的全培分别加入降糖三黄片低、中、高剂量组及模型组,再分别予不同剂量降糖三黄片血清300ul,模型组及高糖组加入全培,干预后入二氧化碳培养箱培养48h后,流式细胞仪检测各组心肌细胞凋亡率。 4.ELISA检测心肌细胞TGF-β1含量。将同检测细胞凋亡干预的心肌细胞上清液离心后,取上清,用ELISA法检测各组的OD值,并根据标准曲线,计算各组的TGF-β1含量。 结果：流式细胞仪观察心肌细胞凋亡率,正常组与模型组相比较具有显著差异(p0.05),降糖三黄片低、中、高组间比较具有显著性差异(p0.05),且其心肌细胞凋亡率随剂量增加而减少,降糖三黄片组与模型组具统计学差异(p0.05),说明降糖三黄片可以抑制高糖诱导的心肌细胞凋亡,且随药物剂量增大,其抑制凋亡率程度越明显; ELISA检测心肌细胞TGF-β1示降糖三黄片低剂量组与高剂量组无统计学差异(p0.05),中剂量组与高剂量、低剂量组有统计学差异(p0.05),同时低剂量组、高剂量组与模型组相比较无统计学意义(p0.05),中剂量组与模型组相比较具有统计学意义(p0.05),说明降糖三黄片低、高剂量对于乳鼠心肌细胞TGF-β1的表达并无显著影响,而中剂量降糖三黄片组可显著下调TGF-β1的表达。 结论：1.中药降糖三黄片可有效改善高糖诱导的心肌细胞凋亡,随浓度增加,抑制凋亡率程度越强。2.中药降糖三黄片中剂量可以显著下调高糖诱导的心肌细胞TGF-β1的表达,其机制可能与上调系膜细胞的GLUT1表达,继而激活蛋白激酶C (PKC)氨基己糖通路有关。 第三部分临床研究 纳入观察病例82例,均明确诊断为糖尿病心脏病。采用随机分组表将患者分为降糖三黄片组和基础治疗组,经1周治疗,对照组患者治疗前后TGF-β1含量比较,经t检验,没有统计学意义(P值为0.94),即对照组患者经治疗后TGF-β1表达下降不明显。对照组患者治疗前后TGF-β1含量比较,经t检验,没有统计学意义(P值为0.94),即对照组患者经治疗后TGF-β1表达下降不明显。降糖三黄片组患者治疗前后TGF-β1含量比较,经t检验,有统计学意义(P值为0.00),即降糖三黄片组患者经治疗后TGF-β1表达下降。治疗前降糖三黄片组与基础治疗组TGF-β1含量比较,经t检验,两组均无统计学意义(P值为0.09),即两组具可比性。 对患者性别,年龄,体重指数,糖尿病病程,血压,血脂,糖化血红蛋白,证型,血压,胰岛素2h释放进行多元回归线性统计分析,发现诸混杂因素中,只有证型对服用降糖三黄片治疗患者血清TGF-β1的下调有影响,即在服用降糖三黄片的人群中,辨证为气阴两虚兼有瘀血证的患者TGF-β1的表达下调更明显。

【关键词】：降糖三黄片 糖尿病心脏病 TGF-β1
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R285.5
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