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《广州中医药大学》 2014年
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土茯苓多糖的提取分离、结构表征及抗炎活性的研究

陈文龙  
【摘要】:目的: 土茯苓,又名刺猪苓,是一种可入药又可作为食料的植物根茎,在我国分布于长江流域以及南各省区,北到甘肃,西至云南,南达海南、台湾等地。土茯苓为菝葜属,性甘平,具有利湿热、解毒、通利关节的功效,因其富含淀粉,可用来酿酒或制糕点。目前对土茯苓的研究主要是对黄酮类为主的小分子物质进行药理研究以及土茯苓的工艺优化,对土茯苓多糖等大分子物质的研究甚少。本文以土茯苓为原料,对土茯苓多糖进行提取工艺,提取分离纯化、结构表征及抗炎活性等方面进行了相关研究,为开发此药拓宽了思路,也为临床治疗提供了研究依据。 方法: 1.本文通过对提取温度,提取时间,料液比以及提取次数的因素考察,以单因素试验和响应面法优化土茯苓多糖的最佳提取工艺。 2.按照最佳提取工艺提取对土茯苓多糖进行乙醇醇沉,Sevag法除蛋白、色素和Sephadex G-150凝胶层析柱进行分离纯化。 3.通过对纯化分离出的多糖部位进行相对分子质量测定、单糖组成测定,初步研究其结构表征。 4.抗炎活性研究 a.MTT法检测土茯苓多糖对RAW264.7巨噬细胞生长的影响; b.Griess法检测土茯苓多糖对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞释放NO的影响; c.ELISA法检测土茯苓多糖对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞释放TNF-α的影响; d.RT-PCR法检测土茯苓多糖对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-6、TNF-α及iNOS mRNA达的影响; e.Western Blot法检测土茯苓多糖对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NF-κB和MAPK信号通路的影响。 结果: 1.单因素结果表明,最佳提取次数为3次,最佳提取温度(℃)为90℃,最佳提取时间(h)为2h,最佳料液比(g/m1)为1:35,响应面分析的提取最佳工艺条件为:提取温度为88℃,提取时间为2.3h,料液比为1:36,最佳工艺的多糖得率平均值为6.41%。 2.在土茯苓多糖最佳提取工艺条件下提取的多糖通过乙醇醇沉,Sevag法除蛋白、色素和Sephadex G-150凝胶层析柱纯化分离得到两个多糖部位tfl-1和tfl-2。 3.本文通过平均分子质量测定和单糖组成测定,求出多糖tfl-1的平均分子质量为377Kd,tfl-2的平均分子质量244Kd,确定tfl-1和tfl-2均由鼠李糖(Rha)和半乳糖(Glc)2种单糖组成。 4.生物活性结果显示,多糖tfl-1和tfl-2对RAW264.7巨噬细胞生长没有抑制作用,对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NO和TNF-α的分泌具有一定抑制作用,能够抑制RAW264.7巨噬细胞IL-6、TNF-α和iNOS mRNA的表达,并对MAPK信号通路相关的P-JNK、P-ERK1/2蛋白的表达也有抑制作用。 结论: 本论文通过对土茯苓多糖的提取工艺研究,得出了可以用来预测和分析土茯苓多糖提取工艺的模型,并通过回归方程得出土茯苓多糖的最佳提取工艺;按照最佳提取工艺,通过提取、分离、纯化方法,得到的土茯苓多糖部位tfl-1和tfl-2相对分子质量均一,纯度较高;结构表征研究发现此2种多糖部位不是同一种多糖。土茯苓多糖tfl-1和tfl-2对巨噬细胞生长无抑制作用,可以抑制巨噬细胞分泌NO和TNF-α,具有良好的抗炎活性,而这种活性可能与抑制IL-6、TNF-α和iNOS mRNA的基因表达和抑制MAPK信号通路相关的P-JNK、P-ERK1/2蛋白的表达有关。
【学位授予单位】:广州中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R284.2;R285

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