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桑叶降糖活性物质DNJ分离纯化及其体外药理活性研究

苏楠  
【摘要】:目的: 1.采用高效液相色谱-蒸发光检测(HPLC-ELSD)法建立一种稳定、可靠、重现性好的桑叶生物碱DNJ(1-脱氧野尻霉素)含量测定方法;并且以DNJ含量为评价指标,在单因素实验基础上,运用响应面分析法(Response Surface Methodology)优选桑叶生物碱提取工艺; 2.以DNJ含量为评价指标,筛选分离纯化桑叶生物碱效果最优的阳离子交换树脂,并考察其上柱液流速、洗脱液浓度及洗脱液流速等影响因素,进而得到最佳分离纯化工艺: 3.考察桑叶生物碱对淀粉酶、蔗糖酶和麦芽糖酶体外抑制活性试验方法;同时,进行酶活性抑制反应条件优化及酶动力学研究,考察桑叶生物碱对其酶活性抑制药理活性。 方法: 1.采用高效液相色谱-蒸发光检测(HPLC-ELSD)法建立桑叶中生物碱含量检测方法,通过单因素及响应面分析法实验,考察乙醇浓度、pH值、料液比及浸提时间4个因素对提取率的影响,得到桑叶生物碱的最佳提取工艺; 2.以DNJ生物碱含量为评价指标,进一步筛选出分离纯化效果最佳的树脂类型;通过考察上柱液流速、洗脱液浓度及洗脱液流速等三个因素,得到桑叶生物碱最佳分离纯化工艺;3.体外模拟α-葡萄糖苷酶反应体系,应用三种α-葡萄糖苷酶,即淀粉酶、蔗糖酶和麦芽糖酶试剂盒,分别进行桑叶生物碱的酶活力抑制率测试实验,利用Lineweaver-Burk双倒数做图法,进一步确定最佳反应体系及酶抑制动力学类型。 结果: 1.采用HPLC-ELSD法,以DIKMA Platisil NH2(4.6mm×250mm,5μm)为色谱柱,流动相为乙腈-水(90:10)、流速为1.0mg·mL-1、ELSD漂移管温度40℃、及载气流速为3.5×105Pa等条件建立生物碱含量测定方法;方法学考察结果显示0.356-2.848mg·mL-1范围内质量浓度与峰面积呈良好线性关系、同时精密度RSD=0.54%、稳定性RSD=0.98%、重现性RSD=1.46%、平均加样回收RSD=2.75%等各项指标均显示此种方法不止精密度高,稳定性和重现性优,且加样回收率亦显示此种方法可行;采用HPLC-ELSD方法来测定桑叶生物碱的含量,确定桑叶生物碱提取的最佳工艺参数为乙醇浓度66.53%、pH值为6.66、浸提时间2.73h;在此条件下,桑叶生物碱实际提取量为0.1946%,较以前的文献研究提取量有明显提高,并且通过3次重复验证试验,结果显示桑叶生物碱DNJ平均提取量为0.1967%, RSD为0.23%。 2.通过工艺考察,筛选出001×7型阳离子交换树脂作为分离生物碱的树脂类型。其最佳分离工艺为:上样液生物碱浓度1.75mg·mL-1洗脱液浓度为氨水乙醇浓度(80:20)、洗脱液流速1.5ml/min进行洗脱效果最佳,经001×7型阳离子交换树脂处理后的桑叶生物碱DNJ在浸膏中含量可达29%以上,并且通过方法学考察实验得到此工艺精密度高,重复性及可操作性强。 3.体外活性试验表明,桑叶DNJ抑制三种α-葡萄糖苷酶活性作用中,其仅对蔗糖酶的抑制作用显著,并且随着DNJ浓度增加抑制率呈正相关递增;考察最佳反应体系实验表明在酶用量为20μ L、反应时间为1lmin和55mg·mL-1底物浓度时为最佳反应条件;另外,Lineweaver-Burk双倒数做图法结果显示DNJ提取物对蔗糖酶抑制反应类型为非竞争性抑制。 结论: 1.HPLC-ELSD法建立的测定桑叶生物碱方法结果重现性好,稳定可行; 2.稀酸稀醇溶媒浸提桑叶生物碱的二次多项数学模型,说明根据Box-Behnken模型、采用响应面分析法得到的桑叶DNJ提取优化工艺准确可靠; 3.001×7型阳离子交换树脂能够用于分离纯化桑叶生物碱,且效果佳得率高; 4.桑叶生物碱DNJ对蔗糖酶活性抑制明显,且为非竞争性抑制。


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