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《广州中医药大学》 2014年
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前沿亲和色谱—质谱联用筛选五味活血化瘀中药中作用于PAI-1的活性成分

赵怡  
【摘要】:目的:1.从丹参、三七、红花、川芎、莪术五种活血化瘀中药中筛选作用于纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的目标成分。2.通过分析各提取物与PAI-1蛋白柱的相互作用,从PAI-1蛋白的水平探讨丹参、三七、红花、川芎、莪术五味中药活血化瘀的可能作用机制。3.考察目标成分对PAI-1蛋白活性的直接影响,探讨其对PAI-1蛋白的可能作用。4.从细胞水平考察目标成分对正常状态的人肾小球系膜细胞(HMC)及模型组中HMC分泌PAI-1蛋白的影响。方法:1.采用前沿亲和色谱-质谱联用技术(FAC-MS)筛选五味活血化瘀中药中作用于PAI-1蛋白目标成分。丹参、三七、红花、川芎、莪术醇提取物及其石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水五个极性部位作为筛选样品,以柯里拉京为阳性对照,找出在PAI-1亲和柱上与柯里拉京保留时间相近或更长的目标成分群,通过分析及用相应的对照品验证,确立目标成分,并测定其解离常数。2.采用目标成分与PAI-1蛋白直接作用的方法,观察其对PAI-1蛋白活性的影响。将 PAI-1 蛋白标准品溶液与 5 u g/mL、10 μ g/mL、20 μ g/mL、40 μ g/mL、80 μ g/mL浓度的目标成分在37℃共同孵育45min,酶联免疫吸附法(ELISA)检测目标成分对PAI-1蛋白活性的影响。3.建立细胞模型,.在细胞水平进行目标成分对PAI-1蛋白活性影响的研究。培养HMC,分为四组,分别是正常对照组、模型组、模型给药组和正常给药组。模型组和模型给药组用5ng/mL的TGF-β 1蛋白干预造模。两个给药组均加入5 u g/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL 浓度的目标成分。培养 48h,MTT 法检测 HMC细胞增殖情况。4.采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞上清液中PAI-1蛋白的活性及含量。5.采用实时荧光定量RT-PCR技术检测目标成分对各组HMC细胞产生的PAI-1 mRNA表达的影响。结果:1.FAC-MS法筛选的实验结果:FAC-MS法能够很好的利用蛋白亲和柱将各个样品中的成分按亲和力强弱进行区分,筛选出一系列比柯里拉京保留时间更长的目标化合物。其中具有保留性好的化合物以丹参最多,其次是川芎、莪术、红花、三七。丹参、川芎、红花以乙酸乙酯部位居多,其次是正丁醇部位。莪术和三七则是以石油醚部位居多。通过与对照品比对,已确认其中的2个化合物,分别是丹参酚酸B(解离常数Kd=14.3819μmoL/L)和 α-亚麻酸(Kd=65.44 μmoL/L)。2.目标成分对PAI-1蛋白直接作用的实验结果:低浓度的丹参酚酸B和α-亚麻酸均能够直接增强PAI-1蛋白的活性,在20 μ g/mL的浓度时达到最大。丹参酚酸B 40μ g/mL和80 μ g/mL两个浓度对PAI-1活性的增强作用呈减弱趋势;α-亚麻酸40 μg/mL和80μg/mL两个浓度则表现为抑制PAI-1的活性,且随浓度增大,抑制作用越强,有显著性差异。3.TGF-β 1蛋白能显著抑制HMC的增殖,显著升高HMC上清液中PAI-1蛋白的含量和活性,也显著上调了 mRNA的表达量,显示所选的HMC病理模型是可行的。4.无论是对于正常状态的HMC还是病理状态的HMC,低浓度的丹参酚酸B和α-亚麻酸均能显著抑制细胞的增殖,高浓度则显著促进细胞的增殖,具有一定的浓度依赖性。5.对细胞上清液中PAI-1活性的影响:低浓度的丹参酚酸B能够显著升高PAI-1的活性,高浓度则没有显著性的差异,其作用趋势与直接作用趋势基本一致;α-亚麻酸低浓度也显著升高了PAI-1的活性,高浓度时有一定的下降趋势,但其40 μg/mL和80μg/mL两个浓度没有显示出较强抑制作用。与模型组比较,模型给药组中丹参酚酸B低浓度能够显著升高PAI-1的活性,高浓度时则没有显著性差异。6.对细胞上清液中PAI-1含量的影响:正常给药组中丹参酚酸B和α-亚麻酸对PAI-1蛋白的含量基本没有影响;模型给药组中丹参酚酸B能够增加PAI-1蛋白的含量,具有一定的浓度依赖性,高浓度时具有显著性差异;α-亚麻酸也能不同程度的增加PAI-1蛋白的含量,10μg/mL、40μg/mL、80μg/mL三个浓度具有显著性差异。7.对HMC中PAI-1 mRNA的影响:正常给药组中丹参酚酸B和α-亚麻酸的PAI-lmRNA的表达量变化不大,仅α-亚麻酸80μg/mL有上调趋势。与模型对照组比较,模型给药组中5μg/mL和80μg/mL的丹参酚酸B对PAI-1mRNA有上调趋势,10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL表现出下调的趋势,但均没有显著性差异;α-亚麻酸5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、80μg/mL均有上调趋势,40μg/mL表现为下调趋势,也都没有显著性差异。结论:1.FAC-MS能够有效的筛选出复杂中药中作用于特定靶标的成分。中药成分复杂,从中筛选出对特定靶标有作用的成分十分困难,而FAC-MS法利用生物大分子与小分子间相互作用的强弱,特异性地将样品中与靶标有亲和作用的成分筛选出来,大大提高筛选的速度,为中药中活性成分的筛选提供了一种有效的方法。2.影响PAI-1蛋白的活性可能是丹参、川芎、莪术、红花活血化瘀的作用机制之一,而丹参、川芎、红花的乙酸乙酯部位是其作用于PAI-1的主要有效部位;而莪术的主要有效部位是石油醚部位。三七中在PAI-1亲和柱上保留时间长的化合物较少,提示三七的活血化瘀作用可能主要不是通过影响PAI-1蛋白的活性来实现的。同时FAC-MS筛选活性成分的实验结果表明,中药的功效是通过多种成分共同作用来实现的。3.在纯蛋白溶液和正常HMC中,丹参酚酸B和α-亚麻酸均能够作用于PAI-1蛋白而影响其活性,但在TGF-β1(5ng/mL)干预的细胞病理模型中,对细胞中PAI-1的mRNA表达、含量和活性均有影响。
【学位授予单位】:广州中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R284.1

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