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《广州中医药大学》 2018年
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青天葵中独脚金内酯合成相关基因NfCCD7的克隆与表达载体的构建

卓一南  
【摘要】:青天葵是岭南地区常用中药材之一,具有润肺止咳、清热凉血、散瘀解毒的功效,临床上多用于治疗肺系疾病。青天葵药材原植物为兰科芋兰属植物毛唇芋兰(Nervilia fordii(Hance)Schiltr.),该植物以无性生殖为主,对生长环境要求苛刻,每株每年一般只长1~2个新球茎,每个球茎只长一片叶子。因此青天葵的繁殖系数非常低,加上人类的过度采挖,其野生资源濒临灭绝,而人工栽培还远不能满足市场需求。为了青天葵中药资源的可持续利用,想方设法扩大其药用资源迫在眉睫。独脚金內酯(Strigolactones,SLs)是在2008年确认的一种具有萜内酯结构的新型植物激素,具有抑制植物分枝生长、促进侧根形成、诱导根毛伸长、叶片衰老和控制中胚轴伸长的功能,在植物的生长发育过程中发挥着重要的作用。目前SLs的生物合成途径已基本研究清楚,它是以类胡萝卜素为底物,经过类胡萝卜素异构酶D27、类胡萝卜素裂解双加氧酶7、类胡萝卜素裂解双加氧酶8和细胞色素单加氧酶P450家族的CYP711A1等酶的作用逐步合成的。本课题组通过挖掘青天葵转录组数据找到了所有已报道的SLs通路的相关基因,说明SLs参与青天葵生长发育调节的可能性较高。鉴于青天葵极少分枝的生长特性,本研究拟从植物生长发育调节的角度对独脚金內酯合成相关基因NfCCD7进行克隆和初步分析,为了解独脚金内酯通路对青天葵植物独特表型的调控作用提供实验依据。主要研究内容和结果包括:(1)基于青天葵转录组Unigenes数据库,筛选青天葵独脚金內酯合成相关基因的Unigenes,其中Unigene43499、Unigene63345和Unigene64643与拟南芥的MAX3基因同源。以Unigene63345序列为依据,采用RACE技术获得青天葵独脚金內酯合成相关基因NfCCD7 cDNA全长序列。利用ORF Finder对NfCCD7进行编码区分析,得到1836 bp的开发阅读框,共编码611个氨基酸。对NfCCD7的蛋白功能域进行预测,NfCCD7蛋白的保守功能域主要集中在第19到第608个氨基酸之间,归属于RPE65超级家族(Retinal pigment epithelial membrane recepter)。(2)以pRI 101 AN-DNA为表达载体,通过In-Fusion Cloning的方法构建了载体pRI 101 AN-EGFP和pRI 101 AN-NfCCD7/EGFP,采用PEG介导的方法将载体质粒转至烟草叶片的原生质体中,培养一段时间后收集细胞,置于荧光显微镜下观察,通过比较两个载体在烟草叶片原生质体的表达情况,初步确定NfCCD7在烟草细胞的叶绿体中表达。(3)以pRI 101 AN-DNA为表达载体,通过In-Fusion Cloning的方法构建了载体pRI 101 AN-NfCCD7,转化农杆菌EHA105后浸染拟南芥,进一步筛选得到了T_1代转基因植株,为通过遗传转化验证NfCCD7在植物的分枝发育中的作用奠定基础。
【学位授予单位】:广州中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S567.239

【参考文献】
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