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《广州中医药大学》 2018年
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两种芋兰属植物LS功能及其调控的初步研究

曾湘达  
【摘要】:分枝是植物适应环境所表现出的复杂的发育性状,是种子植物顶芽和腋芽发育与扩展后的结果,它决定着植物的株型。而植物的株型往往是影响作物生物量和结实量的关键。通过研究植物分枝相关基因,并利用生物基因工程的技术改变植株的形态以获得更理想的株型,可以充分利用自然资源及提高产量,改善濒危物种资源逐年锐减的现状。青天葵(Herba Nervilia Plicatae)为兰科芋兰属多年生宿根草本植物毛唇芋兰[Nervilia fordii(Hance)Schltr.]的干燥全草或叶。临床上主要用于肺结核咳血、小儿疳积、小儿肺炎等疾病。由于其本身自然繁殖数量少,繁殖系数低,加上人们过度采挖,目前野生资源临近枯竭。青天葵同属植物广布芋兰(Nervilia aragoana Gaud.)的药效及化学成分与青天葵极相似,在民间常被当做青天葵用。不同于毛唇芋兰的一块茎一叶,广布芋兰多出现一块茎多叶或一叶多块茎的现象。LS基因即番茄LATERAL SUPPRESSOR,是最早被发现,也是目前了解最为深入的分枝基因。目前在拟南芥、水稻、菊花等植物中均已发现其同源基因能调控植物分枝(分蘖)的形成。课题组前期已经通过对毛唇芋兰转录组平台的数据挖掘及克隆获得毛唇芋兰分枝相关基因NfLS,及用同源克隆的方法获得广布芋兰分枝相关基因NaLS,生物信息学分析发现两者均归属于GRAS转录因子家族。本论文通过研究两种芋兰分枝发育基因LS在模式植物中的功能,观察两种芋兰的LS基因对于模式植物的生长发育的影响是否存在差异,逐步加深对毛唇芋兰及芋兰属植物分枝发育调控机制的了解,以期在生产实践中采用适宜的措施提高其产量,缓解当前青天葵资源濒危的现状。本论文主要研究内容及结果如下:(1)两种芋兰LS蛋白的亚细胞定位观察通过农杆菌注射烟草叶片法分别将携带pRI101-EGFP、pRI101-NaLS-EGFP和pRI101-NfLS-EGFP质粒的农杆菌菌液注射入烟草叶片后,采用激光共聚焦显微镜观察基因在烟草叶片瞬时表达情况;大量提取pRI101-EGFP、pRI101-NaLS-EGFP和pRI101-NfLS-EGFP质粒,通过PEG介导法转化烟草叶片原生质体,采用激光共聚焦显微镜观察NaLS和NfLS基因的亚细胞定位情况。结果:EGFP基因在烟草表皮细胞中的细胞核、细胞膜和细胞质大量表达,定位于细胞核、细胞膜和细胞质中;NaLS、NfLS基因在烟草表皮细胞的细胞核中分布,两者均主要定位于细胞核。说明两者在烟草表皮细胞的核中表达,具备转录因子的一般特性,行使一定的生物学功能。(2)两种芋兰LS蛋白转录激活活性及DNA结合功能分析利用NCBI的数据库序列信息查询及下载拟南芥的LAS序列(Genebank:NC_003070.9),设计引物克隆得到CDS编码区域。根据NaLS、NfLS、LAS基因CDS序列与载体pGBKT7、pGADT7多克隆位点上的酶切位点设计特异性引物,通过一步克隆法构建酵母重组表达载体pGBKT7-NaLS/NfLS/LAS、pGADT7-NaLS/NfLS/LAS;根据参考文献与GRAS家族转录因子结合的基序(AAAACTGAAAGGGAGA)及载体pHIS2的酶切位点设计特异性引物,将两引物变性和复性后通过一步克隆法构建到酵母载体pHIS2上,构建重组质粒pHIS2-SCL。将酵母重组表达载体pGBKT7-NaLS/NfLS/LAS分别转入酵母中表达并分析α-半乳糖苷酶活性;酵母重组表达载体pHIS2-SCL与pGADT7-NaLS/NfLS/LAS共转入酵母中表达,分析NaLS、NfLS、LAS蛋白与特定DNA序列结合情况。结果:NaLS、NfLS蛋白均未显示转录激活活性,LAS蛋白在酵母系统中具有转录激活活性;NaLS、NfLS和LAS均未检测到特异DNA结合活性,不能与基因调控特定DNA序列(AAAACTGAAAGGGAGA)结合。(3)两种芋兰LS基因在烟草与拟南芥中遗传转化及表达分析将携带pRI101-NaLS-EGFP、pRI101-NfLS-EGFP、pRI101-EGFP载体的农杆菌浸染烟草叶盘获得过表达再生烟草,分析植株中异源基因的表达量并观察表型。同时,通过浸花法转染拟南芥,进行抗性筛选与PCR验证阳性植株后,统计分析阳性植株表型,并用实时荧光定量PCR的方法分析LS基因在转基因拟南芥不同组织部位(莲座叶、茎生叶、茎、角果、根)中的表达量。通过模式植物遗传转化分析LS在模式植物中对分枝发育的影响作用。结果:成功获得了过表达再生烟草,分析了不同烟草植株的表达量,观察得到转基因对烟草的生长产生了一定的影响;成功获得了过表达两种芋兰属植物LS基因的拟南芥植株,通过对其表型分析统计发现,NaLS和NfLS两株系的总叶数、莲座叶一级和二级分枝数、植株高度等表型均有显著差异。实时荧光定量PCR分析结果表明,NfLS在各部位中的表达高低顺序为莲座叶茎茎生叶根角果,与在原植物青天葵中的组织表达特异性基本相同,叶片表达量高于根茎和块茎。
【学位授予单位】:广州中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q943.2;S567.239

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 唐然;张博雅;彭小群;张向前;江院;解新明;;华南象草PpCAD基因的亚细胞定位及其在转基因烟草中的异源表达[J];西北植物学报;2015年06期
2 黄琼林;梁凌玲;何瑞;詹若挺;陈蔚文;;应用matK基因鉴别青天葵及其常见混伪品[J];广西植物;2014年03期
3 周莲洁;张富春;王艳;;GRAS家族基因在植物生长、代谢及逆境胁迫中的功能研究进展[J];植物生理学报;2013年09期
4 王艳梅;马天晓;刘震;;泡桐顶芽死亡机制研究进展[J];林业科学;2013年04期
5 黄琼林;马新业;何瑞;詹若挺;陈蔚文;;基于条形码ITS2序列的青天葵及其混伪品分子鉴别[J];生物技术通报;2012年12期
6 史俊;杨鹤同;;植物分枝性状遗传机理的研究进展[J];安徽农学通报(下半月刊);2010年24期
7 谢月英;谭小明;吴庆华;周雅琴;凌征柱;余丽莹;;广西青天葵野生资源现状[J];广西植物;2009年06期
8 姜慧新;沈益新;翟桂玉;刘展生;;施磷对紫花苜蓿分枝生长及产草量的影响[J];草地学报;2009年05期
9 李亚栋;张芊;孙学辉;路铁刚;;植物分枝发育的调控机制[J];中国农业科技导报;2009年04期
10 杜黎明;毛传澡;毛伟海;;植物茎分枝的分子调控[J];中国生物化学与分子生物学报;2008年02期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 杨明贵;甘蓝型油菜GRAS家族基因BnLAS的分离和功能分析[D];华中农业大学;2010年
2 原丽华;黄瓜侧枝抑制基因CLS的克隆和功能验证[D];上海交通大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前3条
1 陈秀珍;两种芋兰分枝发育相关基因LS及其调控区的克隆与表达分析[D];广州中医药大学;2016年
2 聂梦云;烟草萜类代谢途径相关基因的克隆及功能分析[D];西南大学;2016年
3 梁凌玲;青天葵分枝发育相关基因NfLs的克隆与表达分析[D];广州中医药大学;2014年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 田福平;师尚礼;;紫花苜蓿草地土壤碳密度年际变化研究[J];草原与草坪;2015年06期
2 张金林;李惠茹;郭姝媛;王锁民;施华中;韩庆庆;包爱科;马清;;高等植物适应盐逆境研究进展[J];草业学报;2015年12期
3 刘志英;李西良;齐晓;李峰;方珊珊;王宗礼;孙启忠;;1950年以来中国学者对苜蓿属的研究:历史脉络与启示[J];草业学报;2015年10期
4 张凡凡;于磊;马春晖;张前兵;鲁为华;;绿洲区滴灌条件下施磷对紫花苜蓿生产性能及品质的影响[J];草业学报;2015年10期
5 李艳秋;王同智;赵一夫;;长叶红砂光合特性的研究[J];中国草地学报;2015年05期
6 戴茂华;刘丽英;庞昭进;岳秀琴;吴振良;;不同棉花品种对干旱胁迫的生理响应及抗旱性评价[J];中国农学通报;2015年21期
7 贾双双;徐坤;;南方根结线虫侵染对不同抗性番茄砧木渗调物质及羟脯氨酸含量的比较[J];草业学报;2015年07期
8 戴茂华;刘丽英;庞昭进;岳秀琴;王雪征;吴振良;;花铃期干旱胁迫对棉花生理生化指标的影响[J];江西农业学报;2015年07期
9 薛晓兰;石凤翎;乌云塔娜;熊梅;石凤玲;;10个苜蓿杂交组合产量性状的杂种优势与配合力分析[J];草业与畜牧;2015年03期
10 全瑞兰;玉永雄;;淹水对紫花苜蓿南北方品种抗氧化酶和无氧呼吸酶的影响[J];草业学报;2015年05期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 刘磊;不同花色苜蓿(Medicago spp.)种质资源特性研究[D];中国农业科学院;2014年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 屠煦童;张仕杰;陈小云;李宁宁;辛璐;薛晓晖;章镇;渠慎春;;‘南通小方柿’GA2ox基因的克隆、亚细胞定位及表达分析[J];中国农业科学;2015年01期
2 胡可;严雪锋;栗丹;唐晓梅;杨宏;王艳;邓洪渊;马欣荣;;沉默CCR和CAD基因培育低木质素含量转基因多年生黑麦草[J];草业学报;2013年05期
3 黄琼林;梁凌玲;何瑞;詹若挺;陈蔚文;;青天葵及其混伪品的rbcL基因序列鉴定研究(英文)[J];热带作物学报;2012年09期
4 王艳梅;刘震;牛晓锋;;1年生泡桐不同部位顶芽内源激素的动态变化[J];林业科学;2012年07期
5 李美妮;韩蕊莲;韩建萍;姚辉;罗焜;宋经元;;大黄与易混伪品土大黄、虎杖原植物的ITS2序列鉴定[J];环球中医药;2012年03期
6 霍松;陈慧;朱琼华;解新明;;象草4CL基因片段的克隆及RNAi表达载体构建[J];草业学报;2012年01期
7 朱琼华;张向前;霍松;陈慧;李有涵;唐然;解新明;;象草CCR基因的克隆与生物信息学分析(英文)[J];Agricultural Science & Technology;2012年02期
8 石瑞;曹诣斌;陈文荣;郭卫东;;佛手GRAS基因的克隆及表达分析[J];浙江师范大学学报(自然科学版);2011年04期
9 李有涵;唐然;解新明;;华南象草分株构件生长及其生物量分配的相关性[J];生态学杂志;2011年09期
10 王卫锋;太帅帅;王鲁;刘贯山;李凤霞;高晓明;孙玉合;;烟草NtLS基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化[J];中国烟草科学;2011年04期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 肖本泽;抗旱候选基因和启动子的水稻遗传转化分析和田间抗旱性鉴定[D];华中农业大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前9条
1 冷璐;过量表达DXPS和DXR基因对烟草类萜代谢的影响研究[D];贵州大学;2015年
2 梁凌玲;青天葵分枝发育相关基因NfLs的克隆与表达分析[D];广州中医药大学;2014年
3 黄诗玮;OsWRKY12启动子序列响应SA、MeJA和ET应答元件的鉴定[D];湖南农业大学;2013年
4 汪恺;小麦麦谷蛋白基因调控区的分离与功能鉴定[D];山东大学;2013年
5 王莹;玉米WRKY基因启动子的克隆与功能分析[D];安徽农业大学;2011年
6 田洁;0-18标记1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸的合成研究[D];西北大学;2010年
7 梁大伟;拟南芥叶肉原生质体分离及瞬时表达体系的建立[D];兰州大学;2009年
8 常小丽;百合查尔酮合成酶基因花特异启动子的功能分析[D];西北农林科技大学;2008年
9 张吉贞;水稻MOC1基因启动子的克隆与诱导物的筛选[D];华南热带农业大学;2005年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 王毅;海南省五指山兰科植物资源调查[J];琼州大学学报;2004年02期
2 陈秀珍;梁凌玲;李俊仁;汤小婷;詹若挺;何瑞;;携带芋兰属LATERAL SUPPRESSOR(LS)-EGFP融合基因植物表达载体的构建[J];分子植物育种;2015年12期
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 曾湘达;两种芋兰属植物LS功能及其调控的初步研究[D];广州中医药大学;2018年
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