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基于模式生物平台研究酸枣仁汤对斑马鱼睡眠行为的影响

陈子文  
【摘要】:目的:失眠是一种常见的睡眠障碍性疾病,其发病率大概为10%-20%,其中,约有一半具有慢性病程。长期的失眠严重破坏人们的身心健康,给社会和家庭带来沉重的经济负担。现有的用于治疗失眠的药物受限于不可避免的不良副反应。因此,有必要寻找更为安全有效的治疗方法。中医药是一种极具潜力的补充替代治疗方法。酸枣仁汤是传统中医用于失眠治疗的经典方药,全方由酸枣仁、川芎、知母、茯苓、甘草五味药物配伍而成,具有养血安神之功效。目前,其镇静催眠效应已在临床药理研究和斑马鱼外的一些动物模型中被证实,但是仍面临着药效物质基础以及作用机制阐释滞后的问题。斑马鱼模式生物行为学平台的建立为鉴别酸枣仁汤的安眠活性成分以及探究其相关的作用通路提供了新思路和新手段。本研究旨在通过斑马鱼行为学药物筛选平台,评估酸枣仁汤、酸枣仁及其化学成分酸枣仁皂苷A对斑马鱼幼鱼睡眠/觉醒行为的影响,鉴别酸枣仁皂苷A是否为酸枣仁汤的活性成分。通过比较分析酸枣仁皂苷A诱导的行为表型与已表征化合物诱导的行为表型,鉴别酸枣仁皂苷A可能作用的神经信号通路。进一步通过通路依赖性行为学实验和分子生物学实验验证潜在的作用通路。为明晰酸枣仁汤安眠作用的药效物质基础及其潜在的作用机制提供一定数据。方法:采用全自动视频追踪系统对药物处理后的斑马鱼幼鱼进行连续24小时的行为学监测,分析与睡眠/觉醒相关的6个行为学参数(睡眠总时间、睡眠回合的次数、睡眠回合的长度、睡眠潜伏期、总的活动量、觉醒的活动量),并构建行为学指纹图谱进行可视化。分别对睡眠和觉醒行为的代表性参数睡眠总时间和觉醒的活动量以10分钟为间隔进行时间序列分析以及进行定量分析。对酸枣仁皂苷A诱导的行为学指纹图谱与已表征的化合物诱导的行为学指纹图谱进行相关性分析,计算皮尔森相关系数,并用热图可视化结果,同时对酸枣仁皂苷A和已表征的化合物的行为表型进行层次聚类分析,根据相关程度鉴别出候选神经信号通路。此外,利用表型缺陷的秀丽线虫突变体进行通路依赖性行为学实验,验证酸枣仁皂苷A对候选神经通路的影响作用。最后,采用实时荧光定量PCR法检测酸枣仁皂苷A对斑马鱼中的神经通路相关基因的mRNA表达水平的影响,从分子水平验证酸枣仁皂苷A的作用与候选神经通路的相关性。成果:1.与空白对照比较,低、中、高浓度的酸枣仁汤均可增加斑马鱼幼鱼的睡眠总时间、睡眠回合的长度、觉醒时的活动量以及白天的睡眠回合次数,并减少夜间的睡眠回合次数和白天的活动总量,缩短夜间的睡眠潜伏期。此外,低、中浓度酸枣仁汤可引起斑马鱼幼鱼白天的睡眠潜伏期延长,与之相反,高浓度酸枣仁汤可缩短白天的睡眠潜伏期。至于夜间的活动总量,在中、高浓度中表现为增加,在低浓度中则为减少。与空白对照比较,低、中、高浓度的酸枣仁均可增加斑马鱼幼鱼的睡眠总时间、睡眠回合的长度、白天的睡眠回合次数以及夜间的觉醒活动量,并减少睡眠潜伏期、白天的总的活动量以及白天的觉醒活动量。此外,夜间的睡眠回合次数在低浓度时表现为轻微增加,在中、高浓度时表现为减少。而夜间的总的活动量在低浓度时轻微减少,在中、高浓度时则相反。与空白对照相比,低、中、高浓度的酸枣仁皂苷A普遍增加斑马鱼幼鱼的睡眠总时间、睡眠回合的长度以及白天睡眠回合的次数,并减少夜间睡眠回合的次数、总的活动量以及白天的觉醒活动量。此外,在测试的3个酸枣仁皂苷A浓度下,斑马鱼幼鱼的睡眠潜伏期和夜间的觉醒活动量分别表现为较低幅度的减少和较低幅度的增加。2.时间序列分析结果显示,正常斑马鱼幼鱼的睡眠行为大多发生在一天之中的夜间,而觉醒活动大多发生在一天之中的白天,呈现出明显的昼夜节律。与正常对照比较,经不同浓度酸枣仁汤给药处理的幼鱼表现出明显的睡眠总时间延长和不同程度的觉醒活动量增加。经酸枣仁给药处理的幼鱼表现出不同程度的睡眠总时间增加,觉醒的活动量减少。与酸枣仁相似,经酸枣仁皂苷A给药处理的斑马鱼幼鱼睡眠总时间延长,觉醒的活动量减少。此外,经酸枣仁汤、酸枣仁和酸枣仁皂苷A处理的幼鱼同时保留有睡眠/觉醒行为的昼夜节律,表现为在夜间有较长的睡眠时间,在白天有较多的觉醒活动。相反,褪黑素处理的幼鱼其睡眠/觉醒昼夜节律趋于扁平化。3.定量分析显示,与空白对照比较,低浓度和中浓度酸枣仁汤处理后的斑马鱼幼鱼夜间以及白天的睡眠总时间明显增加(P<0.05),而高浓度酸枣仁汤处理后的幼鱼仅明显增加了白天的睡眠总时间(P0.05),其夜间的睡眠总时间无显著变化(P0.05)。此外,中浓度的酸枣仁汤可明显增加斑马鱼幼鱼夜间及白天的觉醒活动量(P0.05),高浓度的酸枣仁汤明显增加幼鱼夜间的觉醒活动量(P0.05),而低浓度的酸枣仁汤对幼鱼的觉醒活动量无明显影响(P>0.05)。与空白对照比较,中浓度和高浓度的酸枣仁分别明显增加了斑马鱼幼鱼夜间和白天的睡眠总时间(P0.05),低浓度的酸枣仁对幼鱼的睡眠总时间无明显影响(P>0.05)。此外,高浓度的酸枣仁明显降低了幼鱼白天的觉醒活动量(P0.05),其余浓度对幼鱼的觉醒活动量均无明显影响(P>0.05)。与空白对照比较,在中浓度的酸枣仁皂苷A作用下,斑马鱼幼鱼的睡眠总时间显著增加(P0.05),而在低浓度和高浓度的酸枣仁皂苷A作用下,斑马鱼幼鱼的睡眠总时间分别仅在夜间和白天显著增加(P0.05)。此外,中浓度的酸枣仁皂苷A显著降低斑马鱼幼鱼白天的觉醒活动量(P0.05),所有测试浓度的酸枣仁皂苷A对夜间的觉醒活动量均无显著影响(P>0.05)。4.浓度间行为表型稳定性分析结果显示,酸枣仁汤低、中、高3个不同浓度间存在较高程度的相关性(浓度间皮尔森相关系数均0.7)。酸枣仁低、中、高3个不同浓度间存在较高程度的相关性(浓度间皮尔森相关系数均0.65)。酸枣仁皂苷A低、中、高3个不同浓度间也存在较高程度的相关性(浓度间皮尔森相关系数均0.8)。5.酸枣仁皂苷A与已表征化合物的行为表型相关性分析发现,酸枣仁皂苷A诱导的行为表型与靶向5-HT能和DA能递质系统的化合物具有较高的相关性。其中5-HT能化合物所占比例更大。层次聚类分析发现,所有药物/化合物分为4大类,其中,低、中、高浓度的酸枣仁皂苷A与调节5-HT能、DA能、GABA能、组胺能、肾上腺素能、腺苷能及褪黑素能的化合物归为一大类,而5-HT能和DA能活性化合物占据较大比例。再深入分类发现,低浓度酸枣仁皂苷A与D2多巴胺激动剂、5-HT再摄取抑制剂、D2/3多巴胺激动剂、5-HT再摄取抑制剂以及mGluR5谷氨酸拮抗剂聚为一类。中浓度和高浓度的酸枣仁皂苷A与D2/3多巴胺激动剂、A3腺苷拮抗剂、5-HT1A受体激动剂、α 1肾上腺素拮抗剂聚为一类。6.秀丽线虫5-HT依赖性咽部抽吸运动检测结果显示,在所测试浓度(30和100μM)下,酸枣仁皂苷A显著增加了野生型N2线虫的咽部抽吸频率(P0.05)。然而,所有测试浓度的酸枣仁皂苷A均没有对tph-1突变线虫的咽部抽吸频率产生明显影响(P>0.05)。7.实时荧光定量PCR结果显示,与正常对照相比,暴露于酸枣仁皂苷A的幼鱼中的sert mRNA表达水平显著下调(P0.05),而5-HT1A的mRNA表达水平无明显变化(P0.05)。结论:1.酸枣仁汤、酸枣仁及酸枣仁皂苷A在斑马鱼幼鱼中均有促进睡眠的作用,酸枣仁皂苷A是酸枣仁汤安眠效应的活性成分之一。2.酸枣仁汤对斑马鱼幼鱼的睡眠/觉醒行为的影响表现为抑制和兴奋的双向调节作用,而酸枣仁、酸枣仁皂苷A仅表现为抑制的单相效应。3.酸枣仁皂苷A可能通过介导5-HT信号通路发挥安眠作用。


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