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《广州中医药大学》 2002年
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中药骨康对破骨细胞活性及凋亡的影响

曹亚飞  
【摘要】: 骨质疏松症是以骨量减少、骨的微观结构退变为特征,导致骨的脆性增加而容易发生骨折的一种全身性骨骼疾病。属于代谢性骨病,无论原发性、还是继发性骨质疏松症,其共同的病理特征是全身骨量减少。 在骨代谢的过程中,破骨细胞在骨吸收过程中起着主要的作用,旧骨被吸收的进展速度和持续时间取决于破骨细胞的骨吸收活性和破骨细胞数量的不断补充。显然,如果破骨细胞的骨吸收活性降低,则旧骨被吸收的范围减少;反之,则吸收的范围增大。 由此可见,破骨细胞的数量、活性情况在骨质疏松症的发生、发展、及转归中起着重要的作用。破骨细胞群体相对平衡状态的维持,其中重要的一种就是通过细胞凋亡的方式来实现的。 骨康是导师的经验方,以“肾主骨”理论为指导,结合“脾肾相关论”、“血瘀论”理论,筛选补骨脂、黄芪、丹参等中药组成,全方具有补肾壮骨、益气健脾、活血通络之功效。相关研究表明,中药骨康可以有效地提高骨质疏松症模型动物的骨密度、骨矿含量以及骨骼的生物力学强度,提高模型动物的雌激素、降钙素及骨钙素的含量,具有抑制骨吸收和促进骨形成的双重作用。骨康药物血清可以直接刺激成骨细胞增殖分化,使成骨细胞的活性及矿化增强。临床研究也表明,中药骨康能够提高骨质疏松病人的骨密度。 为了进一步研究中医治疗骨质疏松症的作用机理并从细胞生物学角度深入研究中药骨康的治疗作用及作用机理,探讨骨康是否是通过抑制破骨细胞的生物活性或者是诱导了破骨细胞的凋亡程序来实现其治疗目的,围绕这个问题我们开展了相关的研究。 一、实验研究 (一)实验方法 1、破骨细胞的分离和培养 用1月龄清洁级SD雄性大鼠5只,无菌条件下分离四肢长骨骨干,用注射器 中药骨康对破骨细胞活性及凋亡的影响 抽取培养液将髓腔内的细胞冲洗出来,将得到的细胞悬液用20O目的筛网过滤后, 调制细胞密度为 IX 10-’·nl,将其分装入盛有载玻片和象牙骨片的 24孔和 6孔培 养板中,用含有 1,25(0}I)。[);胎牛而情培养液在体积分数为 5%的 CO。、温度为 37’C 的培养箱中培养。 2、破骨细胞的鉴定 所培养的细胞通过HE染色、TRAP染色和侵蚀骨片试验等进行破骨细胞的鉴定。 3、添加药物血清 破骨细胞分离和培养并经鉴定证实所培养的细胞为破骨细胞后,将培养的细 胞分为3组:空白血清组、固邦血清组和中药骨康血清组。分别添加相应的药物血 lA。 4、检测指标 根据研究目标,在完成破唱。细胞的分离培养、破骨细胞的鉴定、象牙骨骨片 的制作、药物血清的制备、破骨细胞试验分组等基础上,主要进行以下实验检测 指标:细胞形态学观察、TRM。活性测定。骨吸收陷窝计数及计算机辅助图像分析、 流式细胞仪检测、激光共聚焦显微镜等观察。 (二)实验结果 1。细胞形态学观察 M染色可见,空白血清组的破骨细胞胞浆饱满,内含许多空泡结构,核大呈 圆形,核仁清晰。固邦血清组和中药骨康血清组的破骨细胞胞浆浓缩,核固缩深 染,有的细胞出现核碎裂。 2、1’RAP活性测定 经药物血清作用后的破骨细胞爬片应用TRAP染液染色,可见破骨细胞胞浆 呈现红色,每组随机选取10个显微镜下视野(X叩)计数,结果见空白血清组*RA P 染色阳性细胞数明显多于其余两组(P<0刀1),而其余两组之间无明显差别 J>0刀引。 3、骨吸收陷窝计数及汁算机辅助图像分析 光学显微镜 100倍镜下对整张象牙骨片上的吸收陷窝进行柏照和计数,然后 用图像分析仪计算象牙骨片上的骨吸收陷窝面积,进行定量分析*叫 人结果显 示空白血清组骨吸收陷窝面积和数量明显多于其余两组(P<0刀1),而其余两组之 间无明显差别(P>0.05)。 4。流式细胞仪检测 空白对照组流式细胞仪监测无凋亡峰(亚G;峰)出现,而中药骨康组和固邦 组流式细胞仪监测时在G;期前出现一个陡立的凋亡峰,分别占细胞总数的19%和 23%。 4 中药骨康对破骨细胞活性及凋亡的影响 5、激光共聚焦显微镜观察 共聚焦显微镜观察可见:空白对照组细胞生长良好,细胞间界限清晰,有较 多突起;ONA荧光分布均匀,胞核边缘平滑无裂缺:胞质微丝呈细颗粒状,大小一 致,均匀分布,按一定方向排列。骨康组和固邦组出现的凋亡细胞间界限模糊, 核切面计较对照细胞变小,DNA荧光分布不均而形成缺损或碎裂呈块状;胞质微丝 散乱,排列不规则,荧光强度较对照组细胞明显增强,组成粗大、散乱的强荧光 团。 二、讨论 (一)骨质疏松症的中医病名 中医无骨质疏松症病名,中医历代医书中也无明确的病名与骨质疏松症相对 应,但根据其所描述的临床症状及
【学位授予单位】:广州中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R274

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