中药活性成分对自杀基因旁观者效应增效作用及机制研究

【摘要】：自杀基因治疗是当前很有前景的肿瘤治疗方案,存在的主要问题是转染率不高而对肿瘤杀伤力不足以及安全性问题,而提高旁观者效应是解决存在问题的重要策略。针对旁观者效应主要由缝隙连接细胞通讯(GJIC)、细胞凋亡和免疫调节等介导的机制,目前主要采用基因转染法或药物诱导法以促进GJIC、诱导细胞凋亡或提高患瘤机体免疫功能的措施来提高自杀基因旁观者效应。基因转染法意味着除了自杀基因还要转染另一个促效基因,而且双载体效果比单载体好,而目前体内基因转染效率仍很低,双基因双载体转染操作难度大,双载体潜在毒副作用较大,相对而言药物诱导增强旁观效应操作简便、成本低,可作用于更多靶细胞,因此,具有广阔的应用前景,故本研究选择了后者。中药在细胞凋亡诱导、细胞通讯和免疫调节这三方面都有优势或潜力,不少中药已在临床或实验室证实能直接诱导肿瘤细胞凋亡和提高患瘤机体的免疫力,但有关中药及其活性成分促进GJIC以及增强旁观者效应的研究报导很少。因此,根据旁观者效应机制及药物诱导增强旁观者效应的研究进展、趋势,我们提出假说:能够促进GJIC,或诱导肿瘤细胞凋亡,或改善肿瘤局部炎症免疫状态并提高机体免疫功能的中药活性成分,很可能通过GJIC、细胞凋亡、免疫介导等机制增强自杀基因的旁观者效应,发挥协同性抗肿瘤作用。 研究目的意义:本研究首先建立稳定有效的、针对大鼠和小鼠肝癌的自杀基因HSV1-tk/GCV系统,建立体外高通量筛选旁观者效应增效药物的细胞模型和检测方法,探讨中药活性成分协同性增强自杀基因疗法疗效的可行性,并对细胞水平筛选到的有效中药成分在动物水平进行疗效验证,以找到有肯定作用的中药成分。并进一步探讨中药在调节肿瘤细胞周期、诱导细胞凋亡等方面的机理,以了解有效中药成分增强旁观者效应的作用机制,为进一步阐明中药成分在肿瘤细胞信号传递、细胞周期调控、细胞通讯、肿瘤免疫等方面的药理药效作用打下基础。筛选出能强效协同自杀基因的中药成分后,还可望进一步把针对多种增效机制的多种中药成分组成比单一成分更高效的复方,形成组分与药理药效明确、质量稳定的鸡尾酒式肿瘤基因治疗增效中药复方,为中药新药开发打下基础和提供实验证据。 实验方法: 1.肿瘤自杀基因HSV1-tk/GCV系统(以下简称tk/GCV系统)的构建 ①HSV1-tk基因对大鼠肝癌CBRH7919细胞的转染:用包装细胞PT67/tk分泌的重组逆转录病毒的活性颗粒感染大鼠肝癌CBRH7919细胞,用G418筛选3周获得高耐药性的重组子