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《广州中医药大学》 2007年
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“调肝肾、祛痰瘀”治法方药逆转SHR血管重构的作用机理研究

柳琳  
【摘要】: 第一部分理论探讨 一、血管重构与原发性高血压 血管对血压始终都发挥着自身的重要调节作用。它能产生许多活性物质,调节血管的结构和功能。因此,血管本身障碍及如何纠正这一障碍是高血压发病机制及其防治中的一个重要问题,而其关键又是纠正血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cell,VSMC)结构和功能的改变。 与高血压伴随的血管结构和功能的变化,即是血管重构(Vascular Remodeling,VR)主要包括:①血管壁增厚,尤其是中层肥厚,导致壁与腔之间的比例明显加大,血流阻力和血管对缩血管物质的反应性增强;②阻力血管变得稀少,尤其是直径12-25μm的阻力血管数目明显减少,随之产生一系列血管功能异常。许多研究证实:高血压阻力血管结构变化与VSMC增生和肥大有关。VSMC结构的变化及血管壁肥厚在不同类型的高血压表现都较为相似,即通过VSMC生长和血管壁“重塑”共同作用的结果。 高血压时VSMC通过自分泌、旁分泌和细胞内分泌等多种方式分泌多种生物活性物质调节自身生长,如血小板源生长因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)和转移生长因子—β_1(transforming growth factorβ_1,TGF-β_1),这在高血压血管肥厚的发生发展中起重要作用。大量实验证明钙,尤其是VSMC内游离Ca~(2+),在维持细胞正常功能和许多心血管疾病的发生、发展中具有十分重要的作用。血管平滑肌细胞内游离钙的增多,被认为是原发性高血压发生机制的最后共同途径。当细胞内Ca~(2+)浓度升高后,Ca~(2+)与其细胞内受体钙调素(Calmodin,CaM)结合生成复合物,后者通过一系列磷酸化过程引起平滑肌细胞收缩,并可促进多种癌基因的表达,如c-fos、c-myc、c-myb等,从而引起血管平滑肌肌细胞的增殖和肥厚。 二、逆转血管重构的研究意义及研究概况 血管重构与高血压、动脉粥样硬化和冠心病等多种心血管的疾病的发病有密切的关系,可加速疾病的进程。尽管目前血管重构的机制尚未完全明确,但其有关机制以及逆转心血管重构的研究已成为研究的热点。 目前大多数合成药物往往由于副作用,或是由于联合用药时的拮抗作用,或是由于长期用药所带来的经济负担,仍然处于不断研究探索当中;而中药复方所表现出的整体调节作用,避免了化学药物针对单一的病理环节,从而显示出良好的应用开发前景。本课题组长期以来一直从事中医“调肝肾,祛痰瘀”治法方药防治高血压及其并发症的研究,我们既往的研究工作表明“调肝肾,祛痰瘀”治法方药对高血压病具有良好的整体调节作用。 第二部分实验研究 一、材料和方法 (一)药物 调肝肾、祛痰瘀中药复方(简称“调方”),其组成为:熟地25g、龟版30g(打碎、先煎)、丹参15g、三七5g、钩藤15g(后下)、全瓜萎15g、怀牛膝15g。所用中药均由本校第一附属医院中药房提供,经药剂科鉴定为纯正药材。常规煎煮取汁后浓缩至含生药1.06g/ml。药液常温冷却后,置4℃冰箱内保存备用。 (二)动物分组及给药 1、整体疗效学研究 亲代自发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertensive Rat,SHR)由北京维通利华实验动物有限公司提供,合格证号为0048303,12周龄,清洁级,其中雄性17只,体重250±25g,雌性34只,体重160±25g。SHR按体重及雄、雌1:2的比例随机分为4组。在测定尾动脉收缩压后同笼配对繁育,每笼1雄2雌,每组4笼。 从6周起观察血压测量值;至12周取材,观察血管中膜厚度及与管腔比值、细胞的超微结构。 2、离体培养VSMC重构机制探讨 SHR VSMC原代培养采用贴块法,常规方法制备调方含药血清及正常对照血清,噻唑蓝(MTT)染色法筛选适合VSMC生长的调方含药血清浓度,从钙系统、PDGF—A、TGF—β_1角度探讨调方逆转血管重构的机制。 二、结果 (一)调肝肾、祛痰瘀复方发病前不同时段给药逆转SHR血管重构的整体疗效学影响 本文采用SHR模型研究高血压血管重构的变化,揭示高血压和血管重构在发病前不同时段的关系,由实验的结果可以看出调肝肾、祛痰瘀治法及其组方于发病前和(或)发病早期实施干预,能有效地延缓SHR早期的血压上升,在6周龄后显示出明显的控制血压上升的效果;第6周时S1—4和S1—10组的血压低于另两组,提示“酿乳”这一间接给药方式的效应,其药代动力学有待进一步研究。通过细胞形态计量分析发现,S1—10组对于改善VSM中膜层厚度和内膜损伤与S空白组比较有非常显著性差异,S1—4对于改善VSM中膜层厚度与S空白组比较有显著性差异,而S5—10与S空白组比较无显著性差异。而且,VSMC有超微结果损害,突出表现为胞质内线粒体密度不均匀,形态肿胀,嵴结构紊乱或消失,线粒体是细胞内的重要钙离子库,这种改变提示细胞内钙代谢失调可能是高血压的细胞损害的重要机制。提示调方具有良好的逆转SHR血管重构的作用,早期干预(1—4周)对于血管平滑肌中膜的形成、生长可能有决定性意义。 (二)调肝肾、祛痰瘀复方含药血清对VSMC内钙系统的影响 本实验观察到,各组大鼠血管平滑肌钙离子水平、钙调素水平的变化成时段依赖性,第10周和第12周取材的VSMC内游离[Ca~(2+)]i较第1周和第5周取材组明显增高,可能与血管活性物质和生长因子可能促进细胞膜钙离子通道的开放增加了细胞对钙的摄取有关;第1周和第5周取材组[Ca~(2+)]i与S12比较有非常显著性差异;使用含药血清后,各中药血清组[Ca~(2+)]i均较正常血清组低,虽无统计学意义,但提示调方含药血清有降低胞内游离钙浓度的趋势,使VSMC增殖肥大作用明显减弱,与实验三的结果相结合来看,可能与具有拮抗生长因子促进细胞膜钙离子通道主动转运钙的作用有关。各组VSMC Ca~(2+)—ATP活性变化成时段依赖性,即S1>S5>S10>S12,S1、S5、10中药血清组VSMC Ca~(2+)—ATP活性与S12比较有非常显著性差异,提示Ca~(2+)—ATP活性随高血压的发生、发展有密切关系;使用含药血清后,各中药血清组VSMC Ca~(2+)—ATP活性均较正常血清组高,提示调方含药血清可上调VSMC Ca~(2+)—ATP活性,其机制可能与降低胞内高Ca~(2+)浓度可以进一步上调Ca~(2+)活性有关。 (三)调肝肾、祛痰瘀复方对VSMC内PDGF—A、TGF—β_1的影响 本研究发现:PDGF—A链和TGF—β_1表达在S12,S10_空和S5,S1具有显著差异,S12>S10_空>S10_药>S5_空>S5_药>S1,在S1各组中PDGF-A和TGF—β_1链几乎无表达,S5各组中仅有微量表达,而在S10两组中比较,含药血清组的表达又少于空白组,S10_空与S12的表达量差异不明显。这一结果提示:①这种自身PDGF—A链和TGF—β_1的高表达,可能在自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖肥大、血管功能异常中具有重要作用。②含药血清不同时段给药对PDGF—A链和TGF—β_1表达的抑制作用不同,提示早期干预有重要意义。 第三部分研究结论 一、研究显示,调肝肾、祛痰瘀治法及其方药在高血压发病前不同时段给药,有确切的延缓血压上升的作用,而且作用效果平稳、持久、缓和,以全程给药组作用最佳,从而部分揭示了这一临床组方思路的可行性与合理性。 二、调方能改善VSM中膜厚度和VSMC超微结构,提示调方能逆转高血压血管重构现象,具有一定的血管保护作用,且早期干预(1—4周)对于血管平滑肌中膜的形成、生长可能有决定性意义。 三、调方含药血清有降低Ca~(2+)浓度、CaM活性的趋势,提高钙泵的活性,并能上调钙泵基因的表达,抑制CaM基因的表达,提示其降压作用机制和逆转血管重构的机制可能是通过钙系统起作用。 四、调方含药血清能抑制PDGF-A、TGFβ1蛋白表达,提示其对VSMC的增殖有抑制作用。
【学位授予单位】:广州中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R285.5

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