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溪黄草提取物抗免疫肝损伤作用机理研究

桂蜀华  
【摘要】: 病毒性肝炎是一种全世界常见病,我国属流行严重地区,慢性肝炎的流行严重影响了人民群众的身体健康。由于慢性乙型肝炎是引起肝硬化和原发性肝癌的主要原因,因此在全世界范围内,开展慢性肝炎防治新手段的研究一直是医学界研究的热点。 目前现代医学对慢性肝炎的治疗药物主要分为三类:①抗病毒药物,主要有干扰素和几种核苷类类似物,两大类药物各有优势,也各有缺点,前者疗效肯定,血清转换率较高,有确切的治疗终点,但使用不方便,副作用较大;后者服用方便,疗效可靠,但需要长期用药,治疗终点不确切,易耐药;②免疫调节治疗,包括胸腺肽、治疗性疫苗等,前者调节免疫,增强机体的免疫清除能力,从而实现抑制甚至清除病毒的作用,可联合核苷类似物或干扰素进行治疗,但疗效颇有争议,目前尚无可供临床使用的用于治疗的HBV感染的治疗性疫苗;③护肝降酶药物,如联苯双酯、五味子制剂及某些中草药,这类药物对降低血清转氨酶,退黄疸有一定效果,其中尤以我国自行研发的联苯双酯效果为优,但容易出现停药后反跳,此类药物副作用少,可用于肝炎的辅助性治疗。 由于肝炎病毒复制的特殊性,导致抗病毒剂的寻找在全世界都是一个难题。机体自身的免疫应答在病毒性肝炎的发展机制中具有非常重要的意义,乙型肝炎病毒对肝细胞的损伤主要是由免疫反应引起的,除抗病毒外,促进损伤肝细胞的修复以及寻找针对性较强的免疫调节药物,也是该类疾病治疗药物研究的方向之一。从中草药中研究开发保肝药物是一极具前景的领域,目前由日本从甘草中研制开发的甘草甜素类药物和欧洲所开发的水飞蓟素,是国际天然药物市场上重要的保肝产品,我国自建国以来,在抗肝炎药物的研发领域,一直投入了大量的人力和物力,致力于在中草药中寻找和研发具有抗病毒活性的药物以及具有保肝效果的天然药物制剂,然而由于中药药效物质基础未明及作用机理不清楚,该类药物的研发基本上处于低水平重复状态,至今未有高效低毒的新药问世。 进行抗肝炎药物的筛选及作用机理研究,建立尽可能的符合临床病理过程的动物模型尤为关键。由于机体自身对肝炎病毒的免疫反应引起的肝细胞损伤是慢性肝炎的主要病理机制,故建立免疫肝损伤模型是研究治肝炎新药的较理想模型。近年来运用刀豆蛋白A诱发的小鼠特异性肝损伤,其致病特点与我们目前所知的人类病毒性肝炎的病理机制有许多的相似之处,是典型的T细胞介导的免疫性肝损害,因此本研究选择ConA诱导免疫性肝损伤模型,来探讨溪黄草治疗免疫肝损伤的作用机理。 溪黄草作广东民间习用草药,具有清热利湿,退黄、凉血散瘀等之功效,经资源学调查证实市场上其主流品种为狭基线纹香茶菜。既往的研究结果提示,狭基线纹香茶菜的水提物和醇提物均具有保肝、抑菌、抗炎等作用。进而对水提物进行了免疫肝损伤保护作用的研究,发现对ConA诱导的免疫肝损伤具有显著的保护作用。我校热研所等研究单位,近几年对溪黄草展开了一系列的研究,发现其水提物及醋酸乙酯部位体内均可以抑制鸭乙肝病毒模型DHBV-DNA的量,体外对2.2.15细胞表达乙肝病毒(HBV)抗原有抑制作用。 本研究正是基于以上的背景立题,在既往的工作基础上,深入探讨溪黄草之主流品种,狭基线纹香茶菜的提取物,对免疫肝损伤小鼠的血清酶学及病理组织学的影响;以及研究溪黄草提取物对免疫肝损伤中的重要炎性介质TNF-α、ICAM-1基因表达的影响,及对TNF-α、ICAM-1的上游信号分子NF-κB的表达的影响。以阐明溪黄草护肝作用的可能机制,并为将溪黄草开发为现代化的高效低毒的抗肝炎治疗药物提供基础研究资料。 一溪黄草提取物对免疫肝损伤小鼠血清酶学及病理组织学检查的影响 目的:建立ConA诱导的免疫肝损伤模型,并在此基础上研究溪黄草提取物对免疫肝损伤小鼠血清酶学及病理组织学的影响。方法:将Balb/c小鼠于广州中医药大学实验动物中心SPF级动物房适应性喂养三天后,随机分成5组:正常对照组,模型对照组,阳性对照组(吡咯烷二硫代氨基甲酸盐,PDTC组),中药治疗组(溪黄草提取物大、小剂量组)。从实验第1d开始,分别灌胃给予正常对照组、模型对照组及阳性对照组无菌生理盐水,中药治疗大、小剂量组分别每日给予溪黄草提取物9.2g/kg,4.1g/kg,连续灌胃7d。各组除正常对照组、阳性对照组外,分别于第7d灌胃后半小时尾静脉注射ConA 25mg/kg以造成免疫肝损伤模型,阳性药组在ConA注射前半小时腹腔注射PDTC 120mg/kg。于造模后第4h、8h分别取血,检测血清中ALT、AST水平以及进行肝脏病理组织学检查,并留取肝组织作相应处理后作RT—PCR及免疫组织化学的检测。血清酶学及病理组织检查结果显示:(1)ConA能成功诱导小鼠产生免疫性肝损害:表现为模型组血清ALT、AST水平显著高于正常对照组(P<0.01);而病理组织学显示模型组4h肝细胞胞浆疏松,染色整个变浅,肝细胞索排列破坏,肝窦瘀血普遍,汇管区可见炎性细胞浸润,可见局部点、片状坏死。8h后,细胞排列结构等略有改善,但出现较多嗜酸性变的肝细胞,胞浆为深紫红色,核固缩;(2)溪黄草治疗大剂量组可以显著降低血清中ALT、AST的水平,与模型对照组相比,差异有显著性(P<0.05),小剂量组血清ALT、AST的水平与模型组无显著性差异;溪黄草大剂量组的4h和8h组织学检查结果也提示,肝脏损伤明显减轻于模型组,肝索大部分的结构还在,肝细胞肿胀,部分细胞胞质疏松,肝窦的瘀血减轻,有少量的炎症细胞浸润,可散在点状坏死和嗜酸性变,8h出现较多嗜酸性样变,但明显少于模型组;小剂量组肝损伤较重,肝细胞索排列破坏,大部分细胞肿胀,可见片状坏死,8h细胞排列稍改善,但嗜酸性样变增多,肝窦瘀血严重。结论:溪黄草提取物可以保护小鼠免于ConA诱导的免疫性肝损害,具有降酶护肝的作用。 二溪黄草提取物对免疫肝损伤小鼠TNF-αmRNA和蛋白表达水平的影响 目的:研究溪黄草提取物对免疫肝损伤机制中肿瘤坏死因子(TNF-α)基因表达的影响。方法:免疫组织化学法检测了溪黄草提取物对免疫肝损伤小鼠TNF-α蛋白的表达,半定量逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)法检测溪黄草提取物对免疫肝损伤小鼠TNF-αmRNA的表达。结果:ConA损伤后,小鼠肝组织的TNF-α蛋白及mRNA水平明显升高,溪黄草提取物大剂量组可以降低升高的TNF-α蛋白的表达,同时可以下调免疫肝损伤小鼠升高的TNF-αmRNA的表达,小剂量组效果不明显,小鼠肝组织的TNF-α蛋白及mRNA水平与模型组比较无显著性差异。结论:溪黄草提取物在转录水平即对免疫肝损伤中的炎性细胞因子TNF-α起抑制作用。 三溪黄草提取物对免疫肝损伤小鼠ICAM-1mRNA和蛋白表达水平的影响 目的:研究溪黄草提取物对免疫肝损伤机制中细胞粘附因子(ICAM-1)基因表达的影响。方法:免疫组织化学法检测了溪黄草提取物对免疫肝损伤小鼠ICAM-1蛋白的表达,RT—PCR法检测溪黄草提取物对免疫肝损伤小鼠ICAM-1 mRNA的表达。结果:细胞粘附因子参与了ConA小鼠肝损害的病理进程,小鼠肝组织的ICAM-1蛋白及mRNA表达均明显增强,而溪黄草提取物大剂量组可以降低损伤小鼠ICAM-1蛋白的表达,同时可以下调免疫肝损伤小鼠的ICAM-1mRNA的表达;小剂量组效果不明显,小鼠肝组织的ICAM-1蛋白及mRNA水平与模型组比较无显著性差异。结论:溪黄草提取物通过抑制ICAM-1基因的转录来下调免疫肝损伤中ICAM-1的表达。 四溪黄草提取物对免疫肝损伤小鼠NF-κB蛋白表达水平及核转位的影响 目的:研究溪黄草提取物对免疫肝损伤中核转录因子(NF-κB)的影响。方法:免疫组织化学检测了溪黄草提取物对免疫肝损伤模型小鼠的NF-κB的蛋白表达及对其细胞内分布进行了观察。结果:提示溪黄草提取物大剂量组可以降低损伤小鼠NF-κB蛋白的表达水平,同时可以减少NF-κB从细胞浆进行细胞核的移位,小剂量组效果不明显。结论:溪黄草提取物可以对抗ConA诱导的免疫性肝细胞损伤,其作用机理与溪黄草提取物可以抑制NF-κB的激活,从而下调损伤过程中炎性细胞因子TNF-α和细胞粘附因子ICAM-1的基因转录与表达有关。


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