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《广州中医药大学》 2007年
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黄芪甲苷定向诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

喻锦扬  
【摘要】: 据世界卫生组织预测,至2020年,非传染性疾病将占我国死亡原因的79%,其中心血管病将占首位。心肌梗塞,心肌病,终末期心力衰竭等心血管疾病严重地威胁人类的健康,其根本原因是心肌细胞是终末分化细胞,功能性心肌细胞的减少,坏死心肌不能再生,只能通过瘢痕形成来替代,以至发生顽固心力衰竭乃至死亡,临床中药或西药治疗、介入治疗和手术治疗均不能代替坏死的心肌,而心脏移植由于手术复杂、供体困难和费用高等原因,在临床很难推广。而细胞移植术则为该类心血管疾病的治疗提供了一种全新的治疗策略,即应用组织工程技术将干细胞移植到病损的心肌组织内,使之转化且替代原来的心肌细胞,重建心肌的结构,使衰竭的心功能得到恢复,达到根治的目的。 近年的研究发现,骨髓基质中还存在另一类干细胞称之为骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),在一定的环境和刺激因子作用下可分化为多种组织细胞,在组织工程中,MSCs作为一种重要的种子细胞越来越引起人们的关注,将MSCs诱导分化为心肌细胞移植治疗心肌梗死,为中药与干细胞结合治疗心血管疾病提供新的理论依据。 1、理论研究 间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞,主要存在于全身结缔组织和器官间质中,以骨髓组织中含量最为丰富,胎儿脐血中亦可分离得到。具有向骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、肌细胞、神经细胞、干细胞、脂肪细胞和造血支持间质细胞等分化的能力。同所有的干细胞一样,骨髓间充质干细胞也具有自我更新能力和多向分化潜能。它虽然仅占骨髓单核细胞的0.001%~0.01%,但是却具有惊人的增殖能力。国内外学者在体外培养中将MSCs经细胞传代后用5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)对其进行诱导分化,可见有心肌细胞样超微结构,有心肌特异性基因表达,并有持续的动作电位,表明他们成功地诱导出心肌细胞。另有学者将MSCs直接注入自体心肌组织内,发现有心肌样细胞形成,具有肌钙蛋白T和肌球蛋白重链染色阳性的心肌细胞特异性标志,表明MSCs在体内微环境条件下可以诱导分化为心肌细胞。 近年来,有研究证明中药能有效地诱导MSCs分化为神经元细胞和成骨细胞,并且诱导率高。前期研究表明黄芪甲苷能够定向诱导MSCs分化为心肌样细胞,免疫组织化学鉴定结蛋白(Desmin)和心肌特异性抗体CTnI表达阳性,RT-PCR检测α-MHC和β-MHC表达阳性,且诱导率于5-aza比较无差异。 为进一步研究黄芪甲苷诱导MSCs分化机制及为临床应用提供理论基础,探索中药在干细胞领域应用基础的前景,为中医药治疗心肌坏死提供理论依据,为中医药现代化研究带来新的切入点,本研究选用中药黄芪单体黄芪甲苷对大鼠MSCs进行体外诱导。用免疫组化检测是否有心肌特异性蛋白抗体(cTnT)和神经胶质源纤维酸性蛋白抗体(GFAP)表达,证实AS可定向诱导出心肌样细胞,并检测细胞分化情况,探讨中药诱导机制;干细胞移植治疗急性心肌梗死,观察大鼠心功能和大鼠心脏组织病理变化,探索中药临床应用的基础。 2、实验研究一 目的:探讨黄芪甲苷体外诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)定向分化为为心肌样细胞的机制。 方法:纯种7周SD大鼠,SPF级,雌雄不限,体质量200±10g,由广州中医药大学动物实验中心提供;通过密度梯度离心和贴壁培养法分离大鼠MSCs,体外扩增、培养、用流式细胞仪鉴定MSCs并连续传代至第八代,分组进行体外诱导,AS组(终末浓度为250mg/L)、5-aza组(终末浓度为10μmol/L)。MSCs分别进行24h、48h、72h诱导;并设空白对照组,仅用基本培养基(IMDM)诱导。 诱导后更换新鲜的完全培养基继续培养,每3天换液一次,并观察细胞形态变化,连续4周,之后通过免疫组化SABC试剂盒检测神经胶质源纤维酸性蛋白抗体(GFAP)和心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)。 结果:原代培养的MSCs,24h后均已贴壁,3~4d后细胞呈集落生长,其形态多变化为短梭形,可见核仁。传代后第3d可见细胞体积较原代细胞增大,大部分呈纺锤状或纤维状等多种形态,胞浆透明,胞核明显。应用流式细胞仪检查MSCs表面抗原,CD34表达为阴性,CD44表达为阳性。经AS、5-aza等诱导后,细胞形态从原来的成纤维状变为排列趋于较为一致的长梭形,且体积增大,4周后,细胞周围伸出较多长的突起,体积大小不等,呈梭形,有纤维样结构存在,并出现肌管。免疫组化鉴定:未经诱导MSCs的空白对照组中未发现GFAP、cTnT阳性细胞,已诱导MSCs的药物实验组中cTnT免疫组化染色均可见阳性免疫复合物,同时可见GFAP表达阳性。 结论:大鼠骨髓MSCs体外在AS作用下可分化为心肌样细胞,同时MSCs还可分化为神经元样细胞,提示中药诱导机制可能为多途径、多靶点,丰富了中药在干细胞领域的理论。 3.实验研究二 目的:探索干细胞移植治疗心肌梗死的临床应用基础,观察移植后大鼠心功能和心脏组织病理变化。 方法:纯种SD大鼠,SPF级,雌雄各25只,体质量220±10g,由广州中医药大学动物实验中心提供。大鼠随机分为3个组,正常组(n=10)、模型组(n=11)、干细胞组(n=10),除正常组外,其余2组制备大鼠急性心肌梗塞模型。肉眼观察梗塞区颜色变白,心电图可见ST-T改变,证明心梗模型成功。模型组向梗塞部位下4点心肌内各注射生理盐水10μml,干细胞组向梗塞部位下4点心肌内各注射培养至第6代MSCs10μml,密度1×10~6个/l。逐层关胸,术后腹腔注射青霉素抗感染,饲养4周。4周后,心脏彩超检测大鼠心功能,N-BT染色法检测大鼠心梗面积,组织病理学检测大鼠心脏病理结构改变。 结果:N-BT染色结果,模型组心梗面积25.20±31.97mm~2,干细胞组心梗面积为4.12±2.18mm~2,干细胞组同模型组比较P<0.05,具有有显著差异,具有统计学意义。心脏彩超检测各组大鼠LVEDD、LVESD、EF、SV、CO等结果发现,干细胞组同模型组的大鼠的LVEDD、LVESD、EF、CO比较,P<0.05,有显著差异,具有统计学意义。心脏病理组织学观察到,模型组大鼠坏死心肌由纤维组织替代,形成疤痕,而干细胞组心肌坏死少,心肌未见明显疤痕。 结论:MSCs移植可以改善急性心肌梗塞大鼠的心功能,减少心肌坏死面积,减轻心室重构,防止心衰发生具有重要意义。
【学位授予单位】:广州中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R285.5

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