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《广州中医药大学》 2007年
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DHBV模型定量评价体系的建立及用于评价中药复方抑制DHBV作用

翁瑞文  
【摘要】: 目前全世界大约有4亿人感染了乙肝病毒(Hepatitis B Virus,HBV),每年因此有30万人成为肝癌患者,每年因HBV感染而死亡的人数为50—120万;全世界有1/3的人在其一生中会感染上HBV,HBV慢性感染率从2%—20%不等,对于HBV的研究一直是热点问题。 DHBV与HBV同属嗜肝DNA病毒科,DHBV与HBV在复制形式、致病机理等方面有着众多的相似之处,所以鸭乙肝模型一直被用作抗HBV药物筛选及HBV致病机理研究的动物模型;多年来对于DHBV检测一直采用斑点杂交,该方法具有可进行大规模检测、价格便宜等优势,但精确性不高;而且目前鸭乙肝模型评价药效一般给药10天,这对于药效温和的中药抑制DHBV作用评价则时间太短,且斑点杂交精确性也不高; 鸭胚肝细胞模型一直在国外被认为是唯一一类病毒直接感染、复制的原代细胞模型,很受重视。而其培养上清中的DHBV变化要用斑点杂交进行评价则很困难,且不准确。因此本研究建立了DHBV体内外模型的定量评价体系,并用该评价体系对中药复方的抑制DHBV作用进行了评价。 1通过对Genbank中所公布的所有DHBV全基因序列进行对比,找出保守序列,设计了DHBV荧光定量PCR引物和探针,并构建了包含该套引物探针靶序列的DHBV荧光定量PCR标准品质粒。用探针检测标准品后表明,该方法在8个浓度梯度范围具有良好的线性关系,能够很好的检测最高2×10~7—2copy/25μL反应体系。批内差异最大只有2.03%,批间最大变异系数仅为2.47%。 2通过对NP-40提取法、辛酸钠提取法和达晖生物公司的血清病毒DNA提取试剂盒的对比,最终表明了辛酸钠法与达晖生物试剂盒提取效果相似,NP—40法效果较差。辛酸钠法是适合于DHBV荧光定量PCR标本提取的高效、经济的方法。 3用普通PCR方法对100只1日龄广东麻鸭进行DHBV阳性筛选,用筛选所得先天感染DHBV的鸭作为模型动物对扶正利湿活血复方水煎剂进行抑制DHBV效果评价,共给药1个月,分别于开始给药当天(D0)、给药第10天(D10)、给药第20天(D20)、给药第30天(D30)及停药第5天(P5)采集血清,用荧光定量PCR法进行检测,结果表明,扶正利湿活血复方高、低剂量组在给药后第10、20、30天时均可使先天感染鸭乙肝模型血清DHBV载量明显降低,停药5天后也有一定抑制作用。 4分别对DHBV先天感染和后天感染的鸭胚肝细胞培养上清中DHBV在载量动态变化进行检测,结果表明,先天感染的鸭胚肝细胞中,细胞接种后第1天上清中的病毒含量最高,第2天则有所下降,随后逐渐上升,至第6天后达到稳定波动,但都达不到第一天的水平。但是先天感染DHBV鸭胚肝细胞上清中DHBV载量都在10~8内波动。因此较为稳定。 在后天DHBV感染的鸭胚肝细胞中,DHBV感染时间是在细胞长成单层以后,但其上清中仍然出现了DHBV感染后第一天DHBV载量最高,第二天大幅下降,第三天逐步上升,一直至DHBV感染后第11天达到最高值。这与以前用斑点杂交检测认为DHBV感染后第六天培养上清中的DHBV达到高峰明显不同。但后天感染DHBV的鸭胚肝细胞培养上清中的DHBV载量波动幅度较大,波动范围为1e5—1e8copy/ml之间。 本研究分别以20ul、50ul、100ulDHBV阳性血清感染鸭胚肝细胞,这三种DHBV感染剂量均在第11天时DHBV达到高峰,DHBV含量只在感染后前2天有明显差别,随后均无明显区别。 5用先天感染DHBV的鸭胚肝细胞对扶正利湿活血复方的水提物和醇提物进行抑制DHBV药效评价,共给药5天,结果表明,扶正利湿活血复方水提物3个剂量组均无明显抑制鸭胚肝细胞培养上清中的DHBV作用,而其醇提物则显示明显抑制作用,这表明扶正利湿活血复方水煎剂在鸭体内可能不是通过直接抑制DHBV而起作用。扶正利湿活血复方醇提物显示了明显抑制鸭胚肝细胞培养上清中DHBV的作用,说明醇提物中的成分不同于水提物,其中可能含有直接抑制DHBV作用的物质,值得进一步研究。 本文完整的建立了荧光定量PCR检测DHBV的方法,使DHBV检测敏感性、精确性大大提高;建立了经济而精确高效的血清DHBV提取方法,整合于DHBV定量PCR方法中,使DHBV定量检测可以经济而精确的大规模应用。首次将鸭乙肝动物模型给药时间延长至1月,使之更适合于中药抑制HBV药效评价;首次用荧光定量PCR方法检测了先天感染、后天感染DHBV的鸭胚肝细胞培养上清中DHBV载量的动态变化,并表明先天感染鸭胚肝细胞培养上清中DHBV载量变化在一个数量级之内,比后天感染更适合于抗HBV药效体外评价。通过这些建立了抗DHBV药效体内外定量评价体系,在抗HBV药物体内外模型研究方面作出了创新性工作,提高了模型的精确性、敏感性。 本文还利用建立的抗DHBV药效体内外定量评价体系评价了中药扶正利湿活血复方的抑制DHBV作用,表明该复方水煎剂在给药1月内在体内能够明显降低血清中的DHBV载量;体外在上药5天内,水提物3个剂量均无明显抑制DHBV作用,而醇提物3个剂量均有一定抑制DHBV作用。说明水煎剂体内抑制DHBV可能不是通过直接抑制DHBV而起作用。 本文DHBV定量评价体系如再建立DHBVcccDNA定量检测方法则更加全面;扶正利湿活血复方的抑制DHBV效果仍需要更多重复以确定其效果。
【学位授予单位】:广州中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R285.5

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