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《广州中医药大学》 2008年
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淫羊藿苷诱导骨髓间充质干细胞分化心肌样细胞的实验研究

谢玲玲  
【摘要】: 心肌梗塞后,存活的心肌细胞数量减少,纤维疤痕组织增生,心功能下降,最终发展为缺血性心力衰竭甚至死亡。目前临床所用的治疗手段不能逆转已坏死的心肌,心脏移植由于费用和排斥反应等问题不能得到推广应用。因此,寻找一种新的、更好的治疗手段已成为当务之急。大量的研究人员把研究重点放到了干细胞的移植治疗上,而干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。其中胚胎干细胞由于取材困难等因素的限制,成体干细胞逐渐成为人们研究的重点。骨髓间充质干细胞(MSCs)是成体干细胞的一种,来源于中胚层的间充质。在一定的环境和刺激因子的作用下可分化为多种组织细胞,在组织工程中,MSCs作为一种重要的种子细胞越来越引起人们的关注,将MSCs诱导分化为心肌细胞移植治疗心肌梗塞,为中药与干细胞联合治疗心血管疾病提供新的理论依据。 MSCs属于非造血细胞,其特点是贴壁生长,呈纺锤型的纤维细胞样,国内外研究认为MSCs具有独特的表征和巨大的培养增殖能力,并认为其是多向分化潜能的干细胞,在一定条件下可以分化为骨骼、软骨、肌肉、神经和造血微环境组织等,具有很高的可塑性。国内外学者在体外培养中将MSCs经传代后用5-氮胞苷(5-aza)对其进行诱导分化,可见有心肌细胞样超微结构,有心肌特异性基因表达,并有持续的动作电位,表明他们成功地诱导出心肌细胞。另有研究人员将MSCs直接注射入自体心肌组织内,发现有心肌样细胞形成,具有肌钙蛋白T和肌球蛋白重链染色阳性的心肌细胞特异性标志,表明MSCs在体内微环境条件下可以诱导分化为心肌细胞。MSCs作为一种重要的种子细胞越来越引起人们的关注,研究者把研究重点放在如何对其进行诱导分化为心肌细胞,以期为移植治疗心梗提供新的理论依据。 用于MSCs体外诱导分化为心肌细胞的诱导剂主要是化学物质5-Aza,但5-Aza有一定的毒性,关于中药诱导的报道较少,这可能与干细胞诱导分化研究涉及的技术问题较多,中药介入的条件还不太成熟有关。寻求一种高效安全的诱导剂是干细胞诱导分化研究的关键。 淫羊藿是补肾壮阳类中药,常用于治疗阳虚证,淫羊藿苷(ICA)是其主要活性成分,ICA药理活性主要表现在改善心血管系统功能、增强机体免疫力、促进DNA合成及诱导肿瘤细胞分化等方面。在改善心脑血管系统功能方面,其主要功效为补肾强心、宁心安神、养血除烦。对改善冠心病患者心绞痛等症状及缺血型心电图有较好疗效,并有镇静和降血脂作用。在对该成分体外定向诱导ES细胞分化成心肌细胞的研究中发现:ICA与ES细胞的定向分化呈一定的量效、时效关系。我们考虑ICA是否也与MSCs的定向分化呈一定的量效、时效关系。该诱导分化是否也能促进MSCs在体内对梗死心肌的修复作用。 本课题研究希望通过检测ICA诱导MSCs后的α-MHC、β-MHC等基因的表达,以及Desmin、cTnT、VEGF和BFGF的表达,来探讨ICA是否能诱导MSCs分化为心肌细胞,其最佳的诱导浓度和诱导时间是多少;在体内实验研究中,诱导后的细胞是否能有效改善心梗大鼠的受损心肌,为研究心梗的治疗提供新的研究思路。 目的探讨淫羊藿苷体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的最佳时效和量效关系,并以此为基础,进一步探讨诱导后的MSCs移植治疗心梗大鼠的心肌修复。 方法本课题分为四个实验进行 实验一、按照不同的药物浓度将ICA分为10~(-6)M、10~(-7)M、10~(-8)M、10~(-9)M、10~(-10)M五个浓度梯度,利用MTT法检测不同浓度组对MSCs的增殖影响。同时通过形态学和免疫组化对分离所得的细胞进行表型分子鉴定。 实验二、利用RT-PCR对ICA各浓度组(10~(-6)M、10~(-7)M、10~(-8)M、10~(-9)M)诱导MSCs后,心肌细胞特有的α-MHC、β-MHC和GATA-4的表达情况,探讨ICA诱导MSCs表达心肌细胞特有的α-MHC、β-MHC和GATA-4的时效、量效关系。同时以5-Aza为阳性对照。 实验三、在实验二的基础上进一步探讨诱导后的MSCs分泌VEGF和BFGF的表达情况,同样以5-Aza为阳性对照。 实验四、在实验二和实验三的基础上,把ICA体外诱导后的MSCs经尾静脉注射入大鼠体内2W和4W,通过免疫组化检测心梗部位心肌Desmin、cTnT、VEGF和BFGF的表达情况,同时通过HE染色和Masson染色观察该治疗方法对受损心肌的修复情况。 结果 实验一、采用无菌分离大鼠胫、股骨骨髓腔细胞,并用全贴壁培养法所获得的细胞经传代培养,去掉其中的造血细胞,得到的是骨髓间充质干细胞。与空白对照组比较,10~(-7)M、10~(-8)M的ICA与MSCs共培养48h后,能明显促进MSCs的增殖,P0.01。 实验二、ICA体外促进MSCs分泌α-MHC、β-MHC的最佳浓度是10~(-7)M,最佳的诱导时间是共培养24h后,换成完全培养基培养1W。 实验三、再次确认ICA体外促进MSCs分泌VEGF和BFGF的最佳浓度是10~(-7)M,最佳的诱导时间是共培养24h后,换成完全培养基培养1W。 实验四、把经ICA最佳浓度和时间诱导后的MSCs移植入心梗大鼠体内后,与移植治疗2W组比较,4W组能明显促进Desmin、VEGF和BFGF的表达,梗塞部位心肌纤维化程度减轻,有一定数量的新生血管形成,对梗塞心肌的修复作用明显。 结论 由实验一至实验三可知:①10~(-7)M和10~(-8)M的ICA在体外能促进MSCs增殖;②10~(-7)M和10~(-8)M的ICA能有效促进MSCs心肌发育依赖的α-MHC、β-MHCmRNA的表达,而诱导24h后再换液培养1周是其最佳的诱导时间。③10~(-6)M和10~(-7)M的ICA能显著促进细胞分泌VEGF、bFGF表达。综合以上实验结果,我们认为:ICA体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的最佳浓度是10~(-7)M,最佳诱导时间是诱导24h后再换液培养1周。 在体外实验结果的基础上对MSCs进行诱导,再把诱导后的细胞通过尾静脉注射输入心梗大鼠体内,实验发现:把经10~(-7)M的ICA诱导24h再换液培养1周的MSCs经尾静脉移植,能有效地修复受损心肌,促进该部位Desmin、cTnT、VEGF和BFGF的表达。 已有大量的实验研究针对骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗心梗,较多的研究人员提出:将MSCs通过一定的途径移植到心梗大鼠体内能有效地修复受损心肌。而在本实验中,我们却发现:MSCs没有预先经过一定的处理而直接进行移植治疗,Desmin、cTnT、VEGF和BFGF的表达相对较弱,仅比不做任何治疗的模型组稍好;而经过与ICA共培养后再进行移植,其修复效果理想,Desmin、cTnT、VEGF和BFGF的表达强,效果满意。 综上所述,ICA能促进体外分离的MSCs增殖;还能促进MSCs的α-MHC、β-MHCmRNA的表达;对VEGF和BFGF的分泌同样有促进作用;通过尾静脉注射移植诱导后的MSCs细胞,能修复受损心肌,促进心肌修复所需的Desmin、cTnT、VEGF和BFGF的表达。因此,由本课题研究我们认为:10~(-7)M的ICA与MSCs共培养24h后,在更换为完全培养基培养1周,能诱导MSCs分化为心肌样细胞,经其诱导后的细胞能有效改善心梗后的受损心肌。
【学位授予单位】:广州中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R285.5

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【参考文献】
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3 杜以宽;BMSCs的软骨向诱导分化与调控及经淫羊藿苷干预的研究[D];暨南大学;2009年
4 杨巍;淫羊藿对大鼠骨髓间充质干细胞的影响[D];武汉体育学院;2007年
5 陈书尚;骨髓间充质干细胞移植治疗心力衰竭的实验研究[D];福建医科大学;2005年
6 刘宏志;大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经前体细胞的研究[D];中国医科大学;2005年
7 王艳芳;生物反应器内培养兔骨髓间充质干细胞[D];大连理工大学;2006年
8 陈洁;同种异体移植骨髓间充质干细胞治疗大鼠心梗后心室重构[D];浙江大学;2006年
9 刘弘光;尝试移植骨髓间充质干细胞治疗大鼠糖尿病[D];中国医科大学;2006年
10 董玉泉;兔骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及生物学特性研究[D];青岛大学;2006年
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