青蒿琥酯抗实验性肝纤维化机理的探索性研究

【摘要】： 一、研究目的和意义 病毒性肝炎、酒精及化学毒物等因素长期损伤肝脏导致肝脏慢性炎症性活动,损伤后的肝细胞在修复过程中会形成不同程度的肝纤维化(hepaticfibrosis,HF),其发病率占整个慢性肝炎患者的25%-30%,且呈逐年上升的趋势。肝纤维化治疗不及时将演变为肝硬化或肝癌,而目前认为肝硬化是不可逆转的,肝硬化和肝癌是我国常见疾病和主要死亡病因之一,反之,肝纤维化在早期是可逆转的,但目前本病尚无特效治疗药物,临床应用的药物仅能缓解症状,改善生存质量。因此探讨早期阻滞肝纤维化发展的药物和防治其演变为肝硬化及肝癌的发病机理是非常迫切的。 二、实验研究 1.研究方法 本研究采用CCL_4致小鼠肝纤维化这一模型,采用常规病理学染色技术、特殊染色技术、电镜技术、免疫组化、TUNNEL及免疫荧光等技术来研究青蒿琥酯对纤维化小鼠肝组织的作用机制。 2.研究内容 (1)青蒿琥酯对模型动物纤维化肝脏的形态学影响。 (2)青蒿琥酯对肝组织中TGF-β_1、MMP-1及TIMP-1及ECM成分(如Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原)及Ca~(2+)的分布的影响。 (3)青蒿琥酯对活化HSC增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclearantigen,PCNA)活性的影响。 (4)青蒿琥酯对凋亡基因及其相关Fas、Bcl-2蛋白表达的影响。 (5)免疫荧光检测青蒿琥酯对细胞增殖信号传导通路中PKC的转位的影响。 3.研究结果如下 (1)青蒿琥酯对实验性肝纤维化形态学的影响,HE染色、特殊染色和电镜观察都证明青蒿琥酯对肝组织具有保护作用,表现为在青蒿琥酯能明显保护肝小叶的结构完整,以及阻止纤维间隔的形成作用,并能够对肝细胞起到保护作用。 (2)青蒿琥酯具有使肝细胞内Ca~(2+)分布保持平衡的作用。 (3)青蒿琥酯对实验性肝纤维化小鼠肝内TGF-β_1的影响,研究表明正常组小鼠的TGF-β_1免疫反应阳性产物阳性率最低,染色最浅;模型组则明显升高,与正常组相比免疫反应阳性产物表达明显增强,统计学结果显示具有显著性差异(P＜0.01),治疗Ⅰ组免疫反应阳性产物表达也明显高于正常组,统计学结果显示也具有显著性差异(P＜0.01)。而治疗Ⅱ组和对照组免疫反应阳性产物表达则明显回落,统计学结果显示与正常组相比无差别(P＞0.05),与模型组相比,治疗Ⅰ组统计学结果显示无差别(P＞0.05),而治疗Ⅱ组和对照组具有显著性差异(P＜0.01),结果表明青蒿琥酯具有降低肝内TGF-β_1表达的作用。 (4)青蒿琥酯对实验性肝纤维化小鼠肝内胶原含量的影响,研究表明青蒿琥酯高剂量组能够显著降低肝内Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原的作用,与模型组相比统计学结果显示具有显著性差异(P＜0.01),结果表明青蒿琥酯能使肝内的胶原合成显著减少。 (5)青蒿琥酯对实验性肝纤维化小鼠肝内MMP-1和TIMP-1表达的影响,研究结果表明,青蒿琥酯对MMP-1的表达没有促进作用,与模型组和正常组相比,统计学结果显示并无差异(P＞0.05),但青蒿琥酯组,尤其是高剂量组能使TIMP-1的表达明显降低,统计学结果显示具有显著性差异(P＜0.01),结果表明,肝纤维化时MMP-1的分泌并没有减少,而是活性受到了TIMP-1的抑制,青蒿琥酯能够降低肝内TIMP-1的表达,从而恢复MMP-1/TIMP-1的比例,起到提高降解胶原的能力,促进胞外基质胶原的降解。 (6)青蒿琥酯对实验性肝纤维化小鼠肝内PCNA的影响,研究结果表明,在肝纤维化时PCNA的表达增强,与正常组比具有显著性差异(P＜0.01),而青蒿琥酯能够降低PCNA的表达,与模型组相比具有显著性差异(P＜0.01)。PCNA是细胞增殖处于S期的重要标志,结果表明青蒿琥酯具有抑制PCNA在肝内的表达,其机制可能是通过抑制细胞周期蛋白激酶(CDKs)的作用,阻止PCNA向S期发展,造成其在G_1期的沉积,而起到抗增殖的作用。 (7)青蒿琥酯对实验性肝纤维化小鼠肝内凋亡基因以及fas和bcl-2蛋白表达的影响,研究结果表明,青蒿琥酯具有促进细胞凋亡的作用,尤其是高剂量组,与模型组相比统计学结果显示具有显著性差异(P＜0.01);同时青蒿琥酯对凋亡相关蛋白Fas和bcl-2具有调节作用,青蒿琥酯可使Fas蛋白表达增加,与模型组相比,具有显著性差异(P＜0.01),而可使bcl-2蛋白表达下降,与模型组相比,青蒿琥酯高剂量组统计学结果显示具有显著性差异(P＜0.01)。有人研究认为活化的HSC的凋亡主要依赖Fas/FasL途径介导的凋亡,同时在肝纤维化有bcl-2的表达增加的趋势。本研究表明,青蒿琥酯可以增加细胞凋亡的敏感性,其机制可能是通过调节相关凋亡蛋白如Fas蛋白的表达,同时对抑制凋亡的bcl-2的表达下降,使得凋亡的数量增加而恢复正常的增殖与凋亡平衡的状态。 (8)青蒿琥酯对HSC-T6培养细胞PKC细胞内转位的影响,研究表明青蒿琥酯具有抑制PKC转位的作用,而PKC的转位是PKC活化的标志,同时PKC介导的信号通路是钙依赖性的,体内研究表明bcl-2表达的增加,可使内质网膜的通透性增高,使内质网中的钙离子进入胞浆,从而使PKC活化,而PKC可使HSC向肌成纤维样细胞转化,该细胞可分泌大量胶原,HSC培养细胞的活化过程与体内一致,因此我们认为青蒿琥酯具有稳定内质网膜的作用,阻断了IP_3对内质网膜的作用,使钙离子在内质网中聚集,从而避免激活PKC的表达,同时也使HSC不能活化,间接起到合成胶原的作用,达到抗纤维的目的。另由于PKC没有活化,因此其没有使胞质膜上的钙离子通道磷酸化,胞外的钙离子无法进入胞浆,而MMP降解胶原需要钙离子的存在,所以也促进了胞外胶原的降解,也起到了抗纤维化的作用。 三、研究结论 通过文献回顾和实验研究现把结论归纳如下: 通过以上的研究结果和综合讨论结果我们把结论可以归纳如下: 1.在前人对青蒿琥酯对肝细胞具有保护作用和可以降低肝内脂质过氧化作用的研究基础上,我们从形态学和维持细胞Ca~(2+)平衡态方面给予了佐证,证明青蒿琥酯具有保护肝细胞的作用。 2.青蒿琥酯具有改善肝纤维化组织炎症微环境的作用,其作用是通过抑制使肝细胞、巨噬细胞、活化的肝星状细胞等分泌TGF-β_1的作用而实现的,TGF-β_1可以促进活化的肝星状细胞、肝细胞、内皮细胞对TIMP-1的表达。而TIMP-1可以抑制MMP-1的活性,因此打破了MMP-1/TIMP-1降解的平衡,使得其对胶原特别是Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原得降解作用减弱,造成了肝纤维化的发生。 3.在前人体外证明青蒿琥酯具有抑制细胞增生的基础上,我们在体内实验也证明了青蒿琥酯具有抑制活化的HSC增生的作用,其机制可能是通过抑制细胞周期蛋白激酶(CDKs)的作用,使活化的HSC由G1期向S期的发展中断,造成细胞在G1期的堆积,而起到抑制其增殖的目的。 4.青蒿琥酯具有使活化的HSC凋亡的作用,其作用可能是通过对凋亡相关蛋白的调节实现的,青蒿琥酯可使Fas蛋白表达上调,从而增加其诱导外源性凋亡的发生,同时青蒿琥酯可以下调bcl-2蛋白的表达,使其对Fas的介导的调亡抑制作用减弱,间接促进凋亡的发生,从而恢复肝纤维化时增殖和凋亡的失衡,起到抗肝纤维化的作用。 5.青蒿琥酯具有抑制FAK-PI3K-Akt信号传导通路的作用,其作用主要表现于以下几个方面:(1)青蒿琥酯具有抑制细胞增殖的作用,其机制可能是青蒿琥酯具有稳定内质网膜的作用,从而阻断了IP_3对内质网膜的作用,使Ca~(2+)在内质网中聚集,抑制了信号通路中的关键因子PKC的转位,使核转录因子没有活化从而阻断其基因转录功能,抑制了细胞的增殖;同时PKC的转位能改变HSC内细胞骨架的分布,刺激HSC转化为MFBLC,促进其产生胶原,尤其是Ⅰ型和Ⅲ型胶原。因此通过干预PKC的信号转导通路,消除了HSC的过度增殖和减少其分泌细胞外基质成分的作用,从而起到治疗肝纤维化的作用。(2)青蒿琥酯具有抑制凋亡蛋白bcl-2的表达作用,其机制可能是通过抑制Akt使NF-kB磷酸化,阻断NF-kB的转录功能,使促进细胞存活的Bcl-2家族成员表达减弱,从而促进fas/fasL介导的外源性细胞凋亡的发生。

【关键词】：青蒿琥酯 肝纤维化 凋亡 信号转导
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R285.5
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