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《广州中医药大学》 2009年
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三聚氰胺尿结石模型及中药三金汤干预作用研究

张薇  
【摘要】: 化学物质三聚氰胺混合奶粉诱发婴幼儿尿结石疾病的机理和结石成分尚不明确,临床治疗没有特效解毒方法,仅局限于尿结石的常规治疗,其方法包括药物治疗、外科手术治疗、体外碎石等或对症治疗。但由于该疾病患者是婴幼儿,尿结石常规治疗方法具有一定的适应症和肾损害等并发症,在婴幼儿患者身上实施更加困难。因此,提高药物溶石排石疗效、根治性治疗尿结石和预防复发方面仍是急需解决的难题。中医药在治疗尿结石方面积累了丰富的实践经验和传统方药。生物医学基础理论和临床的发展与人类疾病动物模型的发展密切相关,后者为改进疾病的治疗技术和方法提供实验依据,促进其不断进步。新的疾病和致病因素的出现,虽然困扰着人类的健康,也促进人们对疾病动物模型的不断创新和发展。因此,建立三聚氰胺尿结石动物模型非常重要。 一、研究目的 本研究旨在探讨三聚氰胺尿结石造模方法,建立给药时间短、成模率高、对肾脏毒性小的规范化造模方法,为防治尿结石基础研究提供一种创新模型;验证三金汤对昆明小鼠体内三聚氰胺的清除作用。 二、方法: (一)实验一:三聚氰胺急性毒性实验。本实验研究采用,纯度≥99.0%的三聚氰胺化学纯制剂,昆明小鼠90只,18~22g,雌雄各半,根据参考文献和预试验的LDm和LDn,以0.8的组距将昆明小鼠分7个剂量组经灌胃口服进行急性毒性实验,以期客观评价动物接触三聚氰胺的危害,为其毒性机理提供理论依据。 (二)实验二:高剂量三聚氰胺诱发SD大鼠尿结石的研究。通过给予SD大鼠不同剂量的三聚氰胺,在不同时间段观察肾、输尿管、膀胱的结晶、成石、病理改变;检测血液生化指标。60日龄SPF级SD大鼠190只,雌雄各半,体质量(213±14)g,分为5个给药组各34只,给药组分别给予三聚氰胺0.5、1.0、1.5、2.0、2.5g·kg~(-1)连续灌胃;空白对照组20只,每天灌胃10 g·L~(-1)甲基纤维素蒸馏水溶液(媒体对照)。采用肉眼和体视显微镜观察大鼠肾脏、输尿管和膀胱形态改变,比较各组肾脏、膀胱的质量和脏器指数,观察大鼠血肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、钙(Ca)、磷(P)、镁(Mg)含量变化。 (三)实验三:低剂量三聚氰胺诱发SD大鼠尿结石的研究。60日龄SPF级SD大鼠130只,雌雄各半,体质量(200±24)g,随机分为给药5个组和空白对照组各20只,溶媒体对照组10只。给药组分别给予三聚氰胺0.05、0.1、0.2、0.3、0.4g·kg~(-1)连续灌胃;溶媒体对照组灌胃10g·L~(-1)甲基纤维素蒸馏水2mL·d~(-1),空白对照组灌胃无菌水2mL·d~(-1)。采用体视显微镜观察大鼠肾脏、输尿管和膀胱形态改变,比较各组肾脏、膀胱的质量和脏器指数,观察大鼠血CREA、BUN、UA、Ca、P、Mg含量变化。 (四)实验四:三聚氰胺对SD大鼠内脏器官影响的观察。给药20d、30d对实验二和实验三各组动物取心、肝、脾、肺、肾、膀胱称量脏器质量,计算脏器指数,并进行病理组织学观察。 (五)实验五:中药三金汤对昆明小鼠体内三聚氰胺清除作用的研究。18~22gSPF级昆明小鼠70只,雌雄各半,分为三金汤预防高、中、低剂量3个组、三金汤治疗组、三聚氰胺模型组、溶媒体对照组和空白对照组,每组10只小鼠,雌雄各半。三金汤预防高、中、低剂量组分别按照28.4、14.2、7.08g·kg~(-1)三金汤生药浓度,预先给药2d后灌胃三聚氰胺1.0g·kg~(-1),再灌胃三金汤2d。三金汤治疗组灌胃三聚氰胺1.0g·kg~(-1)后,按照14.2g·kg~(-1)三金汤生药浓度灌胃2d。溶媒体对照组的小鼠灌胃10g·kg~(-1)甲基纤维素蒸馏水40mL·kg~(-1),空白对照组灌胃无菌水40mL·kg~(-1)。实验期间观察小鼠的一般症状,实验结束后取各组小鼠肾和肺,将每组的肾、肺各作为1个样本送检三聚氰胺含量:参照国标《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》GB/T22388-2008,检测肾脏、肺脏三聚氰胺含量。 三、结果 (一)三聚氰胺给予昆明小鼠经灌胃口服的LD_(50)为9366 mg·kg~(-1),LD_(50)可信限8149~10761 mg·kg~(-1);病理观察:肾脏未见结晶,肾、肝、肺有炎性细胞浸润,肺组织有充血、瘀血现象。 (二)高剂量三聚氰胺诱发SD大鼠尿结石情况:给药10d各组大鼠膀胱结石发生率为9%(4/47),给药20d各组大鼠膀胱结石发生率为37%(11/30),输尿管结石发生率为93%(28/30)。给药10d和20d各组大鼠肾脏均肿大呈灰黄色,肾内均出现条索状黄色沉淀物,部分肾脏有点状或片状出血灶。给药20d各组肾内黄色沉淀物开始融合成片状或颗粒状,并在皮质和髓质之间形成黄色弧形光环。给药30d肾脏剖面所见与给药20d基本相同,但黄色沉淀物向肾皮质集中,肾髓质的黄色条索状沉淀物有所减少;0.5、1.5g·kg~(-1)组各1只大鼠在给药30d停药24d后剖检,发现肾脏剖面改变与30d所见比较接近,但2例的输尿管和膀胱未见结石。给药10d、20d、30d各组肾脏质量和脏器指数均是空白对照组的2~3倍。血CREA、BUN、P、Mg明显升高,血Ca稍微升高。 (三)低剂量三聚氰胺诱发SD大鼠尿结石情况:0.4g·kg~(-1)组给药20d,0.2、0.4g·kg~(-1)组给药30d,尿素氮略高于空白对照组;0.4g·kg~(-1)组给药30d,肌酐、尿酸略高于空白对照组。给药20d各组血钙、磷、镁均偏低。给药30d,0.05、0.2、0.3、0.4g·kg~(-1)组左肾质量比空白对照组略为增加。各组肾脏大小、颜色均与正常对照组比较接近,未见结石和明显黄色沉淀物,但有部份肾脏在皮、髓质交界处有点状或片状出血灶。输尿管未见结石。部分膀胱粘膜充血,部分雄性大鼠出现膀胱结石,其中给药20d各组雄性大鼠出现率为52%(13/25),30d各组出现率为56%(14/25),0.3 g·kg~(-1)组给药30d膀胱结石率达70%。膀胱结石颜色多为淡黄色混合白色、白色。 (四)三聚氰胺对SD大鼠内脏器官影响的观察 (1)三聚氰胺给药20d脏器质量和指数观察:0.5~1.5g·kg~(-1)剂量组肾脏、肝脏、脾脏指数与0.05~0.4g·kg~(-1)剂量组、空白对照组、溶媒体对照组比较有显著性差异,0.05~0.4g·kg~(-1)剂量组与空白对照组、溶媒体对照组比较无显著性差异;1.0g·kg~(-1)剂量组左肺指数与0.05-0.4g·kg~(-1)剂量组、溶媒体对照组、空白对照组比较,0.5、1.5g·kg~(-1)剂量组与0.2g·kg~(-1)剂量组、溶媒体对照组比较,均有非常显著性差异(p<0.01);0.1g·kg~(-1)组心脏质量重于0.5、1.0、1.5g·kg~(-1)组,与溶媒体对照组比较,有非常显著差异((p<0.01)。膀胱质量和指数无异常变化。 (2)三聚氰胺给药30d脏器质量和指数观察:0.5~1.5g·kg~(-1)组肾脏、膀胱质量和指数与0.05~0.4g·kg~(-1)组、空白对照组、溶媒体对照组比较有显著性差异,而0.05~0.4g·kg~(-1)组与空白对照组、溶媒体对照组比较无显著性差异;0.4g·kg~(-1)组右肺指数与空白对照组比较,差别有高度显著性差异(p<0.01);0.2g·kg~(-1)组肝脏质量与空白对照组比较有显著性差异(p<0.01);除0.5、1.0g·kg~(-1)剂量组外,其他给药组脾脏质量略有增加,给药组之间及与空白对照组之间差别均无统计学意义;0.1、0.3、0.4g·kg~(-1)组心脏脏器指数与空白对照组比较有显著性差异(p<0.01)。 (3)病理组织学观察:HE染色光镜下可见,空白对照组和溶媒体对照组肾、肝、脾、心、膀胱组织结构正常,而给药组肾、肝、脾表现不同程度的组织损害;0.5~1.5 g·kg~(-1)组20d、30d主要表现为肾小管坏死或水样变性,上皮细胞脱落、炎性细胞浸润,间质及肾小管内见棕褐色结晶,部分大鼠肾盂粘膜内见灶性聚集的结晶,部分粘膜破坏;0.05~0.4g·kg~(-1)组病变较轻,20d、30d仅见部分肾皮质和肾小管坏死,肾髓质基本正常,未见明显结晶形成;0.5~1.5g·kg~(-1)组肝细胞有水样变和极少量炎性细胞浸润;脾索和脾血窦有较多含铁血黄素细胞,且脾血窦中度扩张、瘀血;肺组织出现轻度炎症变化:0.05~0.4 g·kg~(-1)组肝、脾、肺组织仅有极少量炎性细胞浸润;给药组心脏、膀胱病理组织学观察无异常变化。 (五)中药三金汤对动物体内三聚氰胺的清除作用研究:灌胃三聚氰胺24h后,在昆明小鼠的肺脏、肾脏均有三聚氰胺残留,但总体趋势以肾脏残留量高于肺脏;三聚氰胺模型组肾、肺三聚氰胺含量最高,分别为327ng·g~(-1)、177.5ng·g~(-1);三金汤预防高剂量组清除肾、肺三聚氰胺的效果最明显,肾、肺三聚氰胺含量分别降低至58ng·g~(-1)、28.2ng·g~(-1),三金汤清除肾、肺三聚氰胺的效果从高到低依次为:三金汤预防高剂量组>三金汤预防中剂量组>三金汤预防低剂量组>三金汤治疗组。 四、结论 (一)三聚氰胺给予昆明小鼠经灌胃口服的LD_(50)为9366 mg·kg~(-1),参考国家药物急性毒性分级标准,LD_(50)>5000 mg·kg~(-1)时,可以初步认定微毒或无毒(三聚氰胺一次性给药);三聚氰胺可引起肾、肝、肺的炎症反应。 (二)0.5~2.5g·kg~(-1)三聚氰胺连续给药20d可诱发部分SD大鼠产生膀胱结石和输尿管结石,肾脏出现黄色片状或颗粒状沉淀物,也造成肾功能损害。 (三)0.05~0.4g·kg~(-1)三聚氰胺连续给药30d,对肾脏损害轻微,可诱发雄性大鼠膀胱结石,以0.3g·kg~(-1)剂量组成模率70%最高。 (四)三聚氰胺主要损害泌尿系,引起肾脏组织的病变、膀胱和输尿管结石等,也可波及肝、脾、肺,引起轻度损害。 (五)中药复方三金汤对昆明小鼠体内三聚氰胺具有清除作用,以三金汤预防高剂量组的清除效果最佳。
【学位授予单位】:广州中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R285.5

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